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UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
FACULDADE DE MEDICINA
DEPARTAMENTO DE FISIOLOGIA E FARMACOLOGIA
PÓS-GRADUAÇÃO EM FARMACOLOGIA
DERIVADO NITROFENILAMINO POTENCIALIZA EFEITO CITOTÓXICO
DA NOR-β-LAPACHONA INDUZINDO APOPTOSE EM CÉLULAS HL-60
ANA JÉRSIA ARAÚJO
Fortaleza – Ceará
-2009-
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UNIVERSIDADE FEDERAL DO CEARÁ
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
FACULDADE DE MEDICINA
DEPARTAMENTO DE FISIOLOGIA E FARMACOLOGIA
PÓS-GRADUAÇÃO EM FARMACOLOGIA
DERIVADO NITROFENILAMINO POTENCIALIZA EFEITO CITOTÓXICO
DA NOR-β-LAPACHONA INDUZINDO APOPTOSE EM CÉLULAS HL-60
ANA JÉRSIA ARAÚJO
Dissertação submetida à Coordenação do
Programa de Pós-Graduação em
Farmacologia, do Departamento de Fisiologia e
Farmacologia da Faculdade de Medicina da
Universidade Federal do Ceará, como parte
dos requisitos para obtenção do título de
Mestre em Farmacologia.
Orientadora: Dr
a
. Raquel Carvalho Montenegro
Co-orientadora: Profª Dr
a
Letícia Veras Costa Lotufo
Fortaleza – Ceará
-2009-
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ANA JÉRSIA ARAÚJO
DERIVADO NITROFENILAMINO POTENCIALIZA EFEITO CITOTÓXICO DA
NOR-β-LAPACHONA INDUZINDO APOPTOSE EM CÉLULAS HL-60
Dissertação submetida à coordenação do programa de Pós-graduação em
Farmacologia como parte dos requisitos necessários para a obtenção do titulo de
mestre em Farmacologia outorgado pela Universidade Federal do Ceará.
Este documento encontra-se a disposição dos interessados na biblioteca setorial as
referida universidade. A citação de qualquer trecho deste trabalho é permitida, desde
que seja feita em conformidade com as normas da ética científica.
BANCA EXAMINADORA
__________________________________________________
Dr
a
. Raquel Carvalho Montenegro (Orientadora)
Universidade Federal do Ceará
__________________________________________________
Prof
a
. Dr
a
. Letícia Veras Costa Lotufo (Co-orientadora)
Universidade Federal do Ceará
__________________________________________________
Prof
a
. Dr
a
. Ana Paula Negreiros Nunes Alves
Universidade Federal do Ceará
__________________________________________________
Prof
a
. Dr
a
. Geanne Matos de Andrade
Universidade Federal do Ceará
DEDICATÓRIA
À Deus e a minha família por toda
a ajuda
AGRADECIMENTOS
Agradeço primeiramente a Deus, por estar presente em todos os
momentos da minha vida, dando-me força nos momentos difíceis, pelos muitos
momentos de alegria proporcionados e pelas vitórias conquistadas;
À Dra. Raquel Carvalho Montenegro, pela orientação neste trabalho, por
todas as oportunidades ofertadas em todo este período e pelos ensinamentos
que contribuíram muito para a minha formação;
À Dra. Letícia Veras Costa Lotufo pela competência e simplicidade,
pelos bons conselhos, incentivo e orientação e pelos inesquecíveis momentos
de descontração;
À Drª. Cláudia Pessoa, pelo incentivo em implantar novas técnicas no
laboratório e pela busca por novos recursos para o mesmo;
Ao Dr. Manoel Odorico de Moraes, pelo incentivo e contribuição à
pesquisa no Laboratório de Oncologia Experimental e pelo seu bom-humor;
À Drª. Ana Paula Negreiros Nunes Alves, por sempre nos receber de
braços abertos em seu laboratório e pelos excelentes momentos de
descontração;
Ao Delano, namorado dedicado e companheiro, pela ajuda nesse e em
todos os trabalhos desenvolvidos na minha vida acadêmica, pela tranqüilidade,
apoio e acima de tudo, pelo amor que sente por mim (completamente
correspondido);
À minha mãe, pela torcida e por estar sempre orando por mim. Pelo
apoio em todas as minhas decisões, incentivo aos estudos e dedicação;
Aos meus “projetos” de sogro e sogra, pelo espaço sempre reservado
para os estudos, pelo carinho, torcida e apoio em todos os momentos;
Aos amigos do Laboratório de Oncologia Experimental: Adriana Carvalho,
Bruno Cavalcanti, Bruno, Carla Sombra, Cecília Carvalho, Deisy, Elthon Gois,
Germano, Hemerson Iury, Igor, Kézia Lacerda, Kristiana Mousinho, Patrícia
Marçal, Paula Abreu, Rafael, Vanessa, Venúcia, Washington Bastos, Zé
Roberto e a todos que de forma direta ou indireta me ajudaram e que
proporcionaram um convívio agradável dentro e fora do LOE. Em especial,
agradeço a Evelyne Alves e Arinice Costa, por toda a ajuda e
companheirismo, Danilo Damasceno, Paula Jimenez, Felipe Rocha e Diego
Veras, pelos ensinamentos, ajuda e pelos momentos de descontração dentro e
fora do laboratório.
Aos professores, frutos do LOE, Márcio Roberto, Gardênia Militão, Daniel
Bezerra, Marne Vasconcellos e Paulo Michel.
As secretárias Adelânia Marinho e Sheyla por sempre estarem dispostas
a ajudar, pelo apoio e torcida para que tudo de melhor nos aconteça. Obrigada
pela dedicação e pelos bons conselhos;
Aos técnicos: Paulo, D. Fátima e em especial Erivanda França, Silvana
França e a Rogéria Montenegro pela constante ajuda dentro do laboratório e
pelas conversas agradáveis;
Aos funcionários do Departamento de Fisiologia e Farmacologia:
Chiquinho, Alana, Carlos, Iris, Márcia e em especial a Aura Rhanes pela
paciência e ajuda em todos os momentos;
Este trabalho foi realizado graças ao auxílio das seguintes instituições:
Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior - CAPES
Banco do Nordeste do Brasil - BNB
Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq
Financiadora de Estudos e Projetos - FINEP
Fundação Cearense de Amparo a Pesquisa - FUNCAP
Instituto Claude Bernard - InCb
RESUMO
DERIVADO NITROFENILAMINO POTENCIALIZA EFEITO CITOTÓXICO DA
NOR-β-LAPACHONA INDUZINDO APOPTOSE EM CÉLULAS HL-60. Ana
Jérsia Araújo. Orientadora: Raquel Carvalho Montenegro; Co-orientadora: Letícia
Veras Costa-Lotufo. Dissertação de Mestrado. Programa de Pós-Graduação em
Farmacologia. Departamento de Fisiologia e Farmacologia, UFC, 2009.
O esqueleto quinona foi identificado como um importante grupo
farmacofórico para atividade citotóxica de vários compostos utilizados na
clínica, constituindo ainda uma das maiores classes de agentes anticâncer. β-
lapachona é uma das quinonas mais estudadas nos últimos anos. Suas
aplicações mais importantes estão relacionadas às suas ações contra várias
células tumorais. Seu derivado, nor-β-lapachona (composto 1), tem atividade
anticâncer similar. Assim, o objetivo desse trabalho foi avaliar o mecanismo de
ação envolvido na citotoxicidade do composto 1 e de seu derivado ariloamino
(composto 2) em células leucêmicas HL-60. Inicialmente foi investigado o efeito
desses compostos na viabilidade de células HL-60 após 24 horas de
incubação, mostrando CI
50
de 2,92 e 0,48 μM para os compostos 1 e 2,
respectivamente. Acerca da seletividade celular, o composto 1 mostrou forte
seletividade para células tumorais, enquanto que o seu derivado foi apenas
parcialmente seletivo. Estudos feitos em células HL-60 indicaram que o
composto 2 induz morte celular por apoptose como mostrado pelas mudanças
morfológicas, fragmentação do DNA, despolarização da membrana
mitocondrial e externalização da fosfatidilserina. Ambos compostos
aumentaram a geração de espécies reativas de oxigênio (EROs). Nossos
resultados sugerem que a introdução do nitrofenilamino na posição 3 do anel
furano aumenta a citotoxicidade da nor-β-lapachona em células HL-60. Esses
achados apontam para o potencial dessas quinonas sintéticas como modelo
para a produção de novos compostos com propriedades anticâncer.
Palavras chaves: Nor-β-lapachona, derivado nitrofenilamino, citotoxicidade,
apoptose.
ABSTRACT
NITROPHENYLAMINO DERIVATIVE INCREASES CITOTOXIC EFFECT OF
THE NOR-β-LAPACHONE INDUZING APOPTOSIS IN HL-60 CELLS. Ana
Jérsia Araújo, Advisor: Raquel Carvalho Montenegro, Co-Advisor: Letícia Veras Costa-
Lotufo. Master Dissertation. Postgraduation Program on Pharmacology. Department of
Physiology and Pharmacology, Federal University of Ceara, UFC, 2009.
The quinone moiety has been identified as an important
pharmacophoric group for cytotoxic activity of several compounds clinically
used, constituting just one of the major classes of anticancer agents. β-
lapachone is one of the most studied quinones in the last years. Its most
important applications are related to its action against several cancer cells. Its
derivative, nor-β-lapachone (compound 1), has similar anticancer activity. Thus,
the aim of this work was to evaluate the mechanism of action involved in nor-β-
lapachone and its arylamino derivative (compound 2) cytotoxicity in a leukemia
cells model of HL-60 cell line. Initially it was investigated the effect of both the
compounds on HL-60 cells viability after 24 hours of incubation, showing IC
50
values of 2.92 and 0.48 μM to compounds 1 and 2, respectively. Considering
the selectivity, compound 1 showed strong selectivity to cancer cells, while its
derivative was only partially selective. Studies performed in HL-60 cells, after 24
hours, indicated that compound 2 induces cell death by apoptosis as showed by
morphological changes, DNA fragmentation, mitochondrial membrane
depolarization and phosphatidylserine externalization. Both tested compounds
increased generation of reactive oxygen species (ROS). Our results suggest
that a 3-nitro-phenylamino introduction at position 3 of the furane ring enhances
the cytotoxicity of nor-β-lapachone in HL-60 cell line. These findings highlight
the potential of these synthetic quinones as prototypes molecules to produce
new compounds with anticancer properties.
Keywords: Nor-β-lapachone, nitrophenylamino derivatives, cytotoxicity,
apoptosis.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 -
Esquema das fases do ciclo celular............................................... 16
Figura 2 -
Esquema das fases da mitose....................................................... 18
Figura 3 -
Esquema dos pontos de checagem do ciclo celular..................... 19
Figura 4 -
Características morfológicas dos principais tipos de morte
celular............................................................................................ 22
Figura 5 -
Esquema da via intrínsica da apoptose......................................... 26
Figura 6 -
Esquema da via extrínsica da apoptose........................................ 27
Figura 7 -
Estruturas do paclitaxel e seu análogo docetaxel.......................... 30
Figura 8 -
Estruturas da vimblastina e vindesina........................................... 31
Figura 9 -
Estruturas da camptotecina e seus derivados irinotecano e
topotecano.....................................................................................
31
Figura 10 -
Estruturas de quinonas utilizadas na terapia anticâncer............... 32
Figura 11 -
Estruturas dos principais grupos de quinonas (benzo-, nafto- e
antraquinona)................................................................................. 33
Figura 12 -
Estruturas do lapachol e da β-lapachona...................................... 34
Figura 13 -
Estruturas da nor-β-lapachona (composto 1) e seu derivado
nitrofenilamino (composto 2)........................................................ 41
Figura 14 -
Efeito dos compostos 1 e 2 na viabilidade de células leucêmicas
HL-60 determinado por exclusão de azul de tripan após 24
horas de incubação.......................................................... 57
Figura 15 -
Análises morfológicas de células HL-60 por coloração de May-
Grunwald-Giemsa após 24 horas de incubação como os
compostos 1 e 2.............................................................................
59
Figura 16 -
Efeito dos compostos 1 e 2 na viabilidade de células HL-60
coradas com LA/BE determinado por microscopia de
fluorescência após 24 horas de incubação.................................... 60
Figura 17 -
Efeito dos compostos 1 e 2 em células HL-60 sobre a densidade
celular determinada por citometria de fluxo utilizando iodeto de
propídeo após 24 horas de incubação........................... 61
Figura 18 -
Efeito dos compostos 1 e 2 sobre a integridade de membrana de
células leucêmicas HL-60, analisado por citometria de fluxo
utilizando iodeto de propídeo, após 24 horas de incubação........ 62
Figura 19 -
Efeito dos compostos 1 e 2 sobre a fragmentação de DNA de
células leucêmicas de HL-60, analisado por citometria de fluxo
utilizando iodeto de propídeo, após 24 horas de
incubação.................................................................................. 63
Figura 20 -
Efeito dos compostos 1 e 2 sobre a distribuição do ciclo celular
em células leucêmicas (HL-60) determinado por citometria de
fluxo utilizando iodeto de propídeo, após 24 horas de
incubação....................................................................................... 64
Figura 21 -
Efeito dos compostos 1 e 2 sobre o potencial transmembrânico
em células leucêmicas (HL-60) determinado por citometria de
fluxo utilizando rodamina 123, após 24 horas de incubação......... 65
Figura 22 -
Efeito dos compostos 1 e 2 sobre a externalização da
fosfatidilserina em células leucêmicas (HL-60) determinado por
citometria de fluxo utilizando Anexina V-PE e 7-AAD, após 24
horas de incubação........................................................................
66
Figura 23 -
Efeito dos compostos 1 e 2 sobre a geração de EROs em
células HL-60 determinado por citometria de fluxo utilizando H
2
-
DCF-DA, após 1 e 3 horas de incubação...................................... 67
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 -
Efeito dos compostos 1 e 2 na citotoxicidade de células
leucêmicas (HL-60) e normais (CMSP) após 24 horas de
incubação...................................................................................... 56
Tabela 2 -
Efeito dos compostos 1 e 2 sobre a incorporação do BrdU em
células HL-60 após 24 horas de incubação..................................
58
LISTA DE ABREVIATURAS
ANOVA
Analisys of Variance (Análise de variância)
BrdU
Bromodeoxiuridina
DAB
Diaminobenzidina
DMSO
Dimetilsulfóxido
E.P.M.
Erro Padrão da Média
LA/BE
Laranja de Acridina/ Brometo de Etídio
MTT
3-(4,5-dimetil-2-tiazol)-2,5-difenil-brometo de tetrazolium
PBS
Phosphate Buffer Solution (Tampão Fosfato)
RPMI
Roswell Parrk Memorial Institute Medium
U
Unidade
UV
NAC
EROs
7AAD
DCF
H
2
-DCF-DA
CMSP
PE
PS
Ultra-Violeta
N-acetil-L-cisteína
Espécies reativas de Oxigênio
7 amino-actinomicina
Diclorofluoresceina
Diacetato de 2’,7’-diclorodihidrofluoresceina
Células Mononucleares de Sangue Periférico
Ficoertitrina
Fosfatidilserina
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO.................................................................................... 16
1.1. Câncer......................................................................................... 16
1.2. Morte celular................................................................................. 21
1.3. Produtos naturais e a importância da síntese química............... 28
1.4. Quinonas...................................................................................... 32
2. OBJETIVOS........................................................................................ 39
2.1. Geral............................................................................................. 39
2.2. Específicos................................................................................... 39
3. MATERIAIS E MÉTODOS.................................................................. 41
3.1. Materiais utilizados....................................................................... 41
3.2. Metodologias experimentais......................................................... 41
3.2.1. Síntese das quinonas................................................................ 41
3.2.2. Estudo da atividade citotóxica................................................... 41
3.2.2.1. Avaliação da atividade citotóxica – Teste do MTT................. 42
3.2.2.2. Avaliação da atividade citotóxica em células normais in vitro
- Alamar Blue......................................................................................... 43
3.2.3. Estudo do mecanismo de ação em células HL-60................... 44
3.2.3.1. Avaliação da atividade antiproliferativa em células
leucêmicas HL-60 através da exclusão por azul de tripan...................... 44
3.2.3.2. Avaliação da atividade antiproliferativa através da
incorporação do BrdU..............................................................................
45
3.2.3.3. Análise morfológica-Coloração por May-Grunwald-Giemsa.. 46
3.2.3.4. Coloração diferencial por Brometo de Etídio/Laranja de
Acridina....................................................................................................
47
3.3. Citometria de fluxo...................................................................... 49
3.3.1. Determinação da integridade de membrana celular................. 49
3.3.2. Avaliação do ciclo celular e fragmentação de DNA................. 50
3.3.3. Determinação do Potencial Transmembrânico Mitocondrial..... 50
3.3.4. Determinação da Externalização da Fosfatidilserina (PS)........ 51
3.3.5. Geração de Espécies Reativas de Oxigênio (EROs)
intracelulares...........................................................................................
52
4. RESULTADOS................................................................................. 55
4.1. Citotoxicidade dos compostos 1 e 2 em células HL-60.............. 55
4.2. Mecanismo de ação dos compostos 1 e 2................................... 56
4.3. Análise das mudanças morfológicas........................................... 58
4.4. Análise da citometria de fluxo..................................................... 61
5. DISCUSSÃO..................................................................................... 69
6. CONCLUSÃO..................................................................................... 78
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS................................................. 80
ANEXO I............................................................................................. 105
Introdução
16
1. INTRODUÇÃO
1.1. Câncer
A integridade contínua de todo organismo depende da habilidade de
seus componentes celulares de manter a fidelidade do material genético
durante a divisão celular. A principal tarefa do ciclo celular é, portanto, permitir
e garantir a replicação do DNA livre de erros, a segregação cromossômica e a
citocinese (FISCHER et al., 2004).
O ciclo celular é uma seqüência intrínseca de eventos que permite o
crescimento e a replicação das células. É o mecanismo que governa o destino
das células, interpreta os sinais de crescimento recebidos e decide se a célula
deve continuar sua proliferação (FOSTER, 2008). O ciclo celular é subdividido
em quatro subfases: G
1
, S, G
2
e M (VERMEULEN et al., 2003) (Figura 1).
Figura 1: Esquema das fases do ciclo celular
No estado de não-crescimento ou não-competência (fase G
0
), as células
permanecem quiescentes até que algum estímulo as induza ao estado de
competência ou crescimento, onde se inicia o processo de replicação do DNA e
culmina com a divisão celular (LOURO et al., 2002).
17
As células que estiverem aptas a se replicar movem-se da fase G
0
(fase
de repouso) para a fase G
1
do ciclo, entrando então na fase de síntese de DNA
(fase S). A fase S é seguida pela fase G
2
, onde as células se preparam para
entrar na mitose e se dividir (HARTWELL & KASTAN, 1994).
A fase G
1
(primeiro intervalo) do ciclo celular precede o início da síntese
de DNA (fase S). É nesta fase que proteínas e RNA são sintetizados e que
ocorre a estimulação do crescimento celular ou a parada temporária (fase G
0
)
da mesma. A decisão crítica é tomada em uma fase de transição que é
chamada de ponto de restrição ou ponto R. Tendo passado o ponto de
restrição no final da fase G
1
, a célula entrará na fase S, onde a síntese de DNA
ocorre (LOURO, et al., 2002; KING,et al., 1996).
Na fase de síntese (fase S), todo o DNA deve ser fidedignamente
replicado. Após essa fase, uma célula pode estar pronta para entrar
diretamente na fase M (mitose), no entanto, a maioria das células retarda a
entrada nessa fase para um segundo intervalo (fase G
2
), onde o ciclo celular é
interrompido para que os sistemas de reparo do DNA possam conferir e corrigir
erros, excisar adutos e substituir bases erradas antes do prosseguimento do
ciclo (LOURO et al., 2002, WEINBERG, 2008). Assim, os processos de
reorganização geral na síntese celular ocorrem durante a fase G
2
, incluindo a
regulação do dano não reparado do DNA (FOSTER, 2008).
Durante a mitose, as células que estão se proliferando sofrem várias
mudanças estruturais e morfológicas, que são caracterizadas por condensação
da cromatina, formação do fuso, fragmentação do envelope nuclear e
reorganização do citoesqueleto (VAKIFAHMETOGLU et al., 2008). A fase M
(mitose) constitui principalmente de quatro subfases distintas: prófase,
metáfase, anáfase e telófase, que culmina com a citocinese e divisão do
citoplasma, resultando em duas novas células (JACKSON et al., 2007;
WEINBERG, 2008) (Figura 2).
18
Figura 2: Fases da mitose. Adaptada de Jackson et al., 2007
Para garantir a estabilidade genética, o ciclo celular possui os pontos de
checagem, também conhecidos como checkpoints, que são mecanismos
responsáveis pelo monitoramento dos eventos celulares e impedem a
proliferação de células com algum dano não reparado (LOURO et al., 2002;
FOSTER, 2008; WEINBERG, 2008). Os pontos de checagem impõem um
controle de qualidade para assegurar que a célula tenha completado
apropriadamente todos os requisitos de uma fase do ciclo celular antes de ser
autorizada a avançar para a próxima fase. Assim, os checkpoints operam ao
longo de todo o ciclo celular (FOSTER, 2008). Atualmente, três checkpoints
são descritos: Checkpoint de dano do DNA, que está apto a bloquear o ciclo
celular nas fases G
1
, S, G
2
e mitose; Checkpoint de replicação do DNA, que
monitora a progressão através da fase S; Checkpoint do fuso mitótico (“mitotic
spindle checkpoint”), que monitora a ligação dos cromossomos aos
microtúbulos (FISCHER et al., 2004; FOSTER, 2008). (Figura 3).
19
Figura 3: Esquema dos pontos de checagem do ciclo celular
A ativação de um ponto de checagem possibilitará o reparo das lesões
detectadas. Caso o reparo não seja possível, o ciclo celular será interrompido
ou a célula será induzida a morte (FISCHER et al., 2004).
Nas células tumorais, os checkpoints são freqüentemente ignorados,
resultando em instabilidade genética e conseqüente vantagem proliferativa de
células cancerosas, quando comparadas com as células normais (FISCHER et
al., 2004). As células tumorais mostram uma perda no controle da proliferação
celular (ponto de restrição) e, muitas vezes, tornam-se independentes de sinais
mitogênicos para a sua progressão através das diferentes fases do ciclo celular
(HANAHAN & WEINBERG, 2000; LOURO et al., 2002). A perda do controle da
proliferação celular envolve mutações em genes reguladores do ciclo celular,
os proto-oncogenes e genes supressores tumorais, o que caracteriza o câncer
como uma doença genética (LOURO et al., 2002; FOSTER, 2008). Dessa
forma, as alterações nos mecanismos de regulação do ciclo celular tornam a
20
célula apta a passar pelo ciclo celular sem a devida checagem e, portanto
fazendo com que esta acumule uma série de mutações que contribuem para o
surgimento das características malignas do tumor, como auto-suficiência na
sinalização de fatores de crescimento, insensibilidade aos inibidores de
crescimento, evasão da morte celular programada (apoptose), potencial
replicativo ilimitado, angiogênese e invasão tecidual e metástase (HANAHAN &
WEINBERG, 2000; LOURO et al., 2002; FOSTER, 2008). Portanto, as células
cancerosas diferem das células normais, pelo fato de continuarem a crescer e
se dividir, não obedecendo ao controle biológico natural do organismo
(HANAHAN & WEINBERG, 2000).
Mesmo após importantes avanços no entendimento das neoplasias, o
câncer apresenta-se como a segunda causa de morte por doenças no mundo,
sendo diagnosticados cerca de 10 milhões de novos casos a cada ano
(SCHOTTENFELD & BEEBE-DIMMER, 2005). Nos Estados Unidos avalia-se
que metade dos homens e um terço das mulheres irão desenvolver cânceres
durante suas vidas (ACS - American Cancer Society, 2007). No Brasil, as
estimativas para o ano de 2009 apontam que ocorrerão cerca de 466.730
novos casos de câncer (INCA, 2009).
Atualmente, as terapias anticâncer mais usadas, após a cirurgia, são a
quimioterapia, a radiação ionizante, a imunoterapia e a terapia gênica (KUMAR
et al., 2004). A quimioterapia consiste em um tratamento a base de fármacos
que interferem no processo de crescimento e divisão celular de células
cancerígenas (SOUZA et al., 2007). O objetivo primário da quimioterapia é
destruir as células neoplásicas, preservando as células normais (FULDA &
DEBATIN, 2004).
No entanto, apesar do considerável arsenal de drogas já existentes para
o tratamento do câncer, em muitos casos, o sucesso terapêutico não é
alcançado por causa de falhas nos esquemas terapêuticos, altos índices de
recidivas, redução da sobrevida dos pacientes e dos efeitos adversos, o que
leva a uma contínua busca por novos fármacos (SALGALLER & LODGER,
1998). O fármaco ideal deve aumentar a especificidade, protegendo tecidos
21
normais, minimizar o desconforto dos pacientes e aumentar a eficácia,
resultando na erradicação da massa heterogênea do tumor (BRANNON-
PEPPAS & BLANCHETTE, 2004). Diante desse quadro, é importante que
novas estratégias como o restabelecimento do controle do ciclo celular com
drogas que agem nos pontos de checagem, possam ser disponibilizadas como
uma estratégia viável na terapia anticâncer (FISCHER et al., 2004).
Nos últimos anos, muitos pesquisadores têm focado seus estudos para
compreender as alterações moleculares e genéticas responsáveis pela
malignidade dos tumores. Dentre as terapias mais modernas, destaca-se a
terapia-alvo. Esta tem como objetivo agir em alvos presentes somente em
células tumorais, alvos estes com o papel na carcinogênese e na sobrevida
dessas células (ROSA et al., 2008).
Dentre as drogas-alvo em uso clínico podemos citar o mesilato de
imatinib (Glivec
®
), um inibidor de tirosina quinase (Bcr-Abl) que se destacou no
tratamento de leucemia mielóide crônica (LMC) (DRUKER et al., 2001), e ao
Trastuzumab (Herceptin
®
), um anticorpo monoclonal humanizado utilizado em
pacientes com câncer de mama HER2 positivo (SLAMON & PEGRAM, 2001;
SLAMON et al., 2001; PICCART-GEBHART et al., 2005; JOENSUU et al.,
2006). Dessa maneira, o uso de quimioterápicos no tratamento antineoplásico
tem como finalidade induzir a morte das células tumorais (FULDA & DEBATIN,
2004) sem, no entanto atingir as células normais, ou que, se houver algum
efeito tóxico, que este seja reduzido nas células normais.
1.2. Morte celular
O equilíbrio entre a proliferação e a morte celular regula e controla o
número de células no organismo. A cascata de eventos, bioquímicos e
fisiológicos, que leva a mudanças na síntese de macromoléculas, na
homeostase celular, na regulação do volume celular, e finalmente na perda da
viabilidade celular está intimamente relacionada às mudanças morfológicas
características de cada tipo de morte celular (TINARI et al., 2008).
22
A morte celular pode ser classificada de acordo com sua aparência morfológica
(apoptose, necrose, autofagia ou catástrofe mitótica – Figura 4), critérios com
base em enzimas (com ou sem o envolvimento de nucleases ou de classes
distintas de proteases, tais como caspases, catepsinas e glutaminases),
aspectos funcionais (programada ou acidental, fisiológica ou patológica) ou
características imunológicas (imunogênicas ou não imunogênicas) (MELINO,
2001; OKADA & MAK, 2004; GALLUZZI et al 2007).
Figura 4: Características morfológicas dos principais tipos de morte celular. PS:
fosfatidilserina; LC3: proteína citoplasmática que é considerada um marcador da
macroautofagia. Fonte: Bruin & Medema, 2008.
A morte celular programada é uma forma geneticamente controlada de
suicídio celular que é crucial para o desenvolvimento e homeostase de
organismos multicelulares (KIM et al., 2006). São descritos três tipos de morte
celular programada (BURSCH et al., 2000; KIM, 2005):
9 Tipo I: é a morte celular por apoptose, que inclui mudanças morfológicas
tais como compactação celular, prolongamentos da membrana
23
plasmática, chamados de “blebbing”, e extensiva condensação da
cromatina e fragmentação internucleossomal de DNA.
9 Tipo II: é a morte celular por autofagia. Esta é caracterizada pela
formação de vacúolos autofágicos no citoplasma de células que estão
em processo de morte.
9 Tipo III: é a morte celular por necrose, onde a célula perde rapidamente
a sua integridade de membrana, extravasando seu conteúdo intracelular.
A expressão “catástrofe mitótica” tem sido utilizada para definir um
processo que pode levar a morte celular. Ainda não há uma definição
totalmente aceita para esse termo, no entanto alguns pesquisadores definiram
catástrofe mitótica, em termos morfológicos, como um tipo de morte celular
resultante de mitose aberrante, que geralmente culmina na formação de células
grandes micronucleadas e cromatina descondensada (SWANSON et al., 1995;
IANZINI & MACKEY, 1997; RONINSON et al., 2001).
A apoptose é caracterizada por ser uma via de morte essencial para a
homeostase do organismo, sendo responsável pelo controle da população
celular em tecidos específicos, nos órgãos e estruturas em formação (LOURO
et al., 2002). O processo de morte na apoptose ocorre de maneira altamente
controlada, permitindo a fagocitose dos componentes das células danificadas,
evitando assim uma resposta imune e subseqüente processo inflamatório
(VAN CRUCHTEN & VAN DEN BROECK, 2002).
O processo apoptótico é caracterizado por mudanças morfológicas
típicas e bem definidas, além da formação de corpos apoptóticos que contém
material nuclear e citoplasmático que são subseqüentemente fagocitados por
macrófagos, não havendo assim extravasamento de material pró-inflamatório
(KERR et al, 1972) (Figura 5). Dentre as mudanças bioquímicas características
da apoptose estão a clivagem proteolítica por caspase (RICCI & ZONG, 2006),
externalização da fosfatidilserina (PS) (FADOK et al, 1992; DENECKER et al,
2001), mudanças na permeabilidade da membrana mitocondrial com perda do
potencial de membrana (KROEMER & REED, 2000, RICCI & ZONG, 2006),
24
liberação de proteínas presentes no espaço intermembranar da mitocôndria
(VAN LOO et al, 2002), dentre outras.
Há duas vias distintas de sinalização molecular que levam à morte
celular por apoptose, a via intrínseca ou mitocondrial e a via extrínseca ou via
do receptor de morte (DANIAL & KORSMEYER, 2004; NAGATA, 1997; CORY
& ADAMS, 2002; GRIVICICH et al., 2007).
A via intrínseca é geralmente ativada em resposta a sinais de estresse
intra e/ou extracelulares. Os sinais de estresse intracelulares tais como danos
ao DNA, altos níveis de espécies reativas de oxigênio (EROs), hipoxia,
infecção viral e ativação de oncogenes (HENGARTNER, 2000; RICCI & ZONG,
2006; BRUIN & MEDEMA, 2008) levam à permeabilização da membrana
mitocondrial externa.
Além da função de produzir energia na forma de ATP, a mitocôndria atua
em um papel crítico na regulação da morte celular por apoptose. A
permeabilização da membrana mitocondrial induz a formação de poros por
onde são liberadas pequenas moléculas do seu espaço intermembranar
(PARONE et al., 2002, KIM et al., 2006). Essas moléculas são proteínas
apoptogênicas que incluem citocromo c (LIU et al., 1996), Smac/DIABLO (DU
et al., 2000), AIF (Fatores de indução de apoptose) (SUSIN, et al., 1999) e
endonuceases (LI et al., 2001), resultando em apoptose caspase dependente e
caspase independente (DONOVAN & COTTER, 2004).
Um dos reguladores mais importantes da abertura desses poros são
membros da família de proteínas Bcl-2 anti- e pro-apoptóticas, tais como Bcl-
2/Bcl
XL
e Bax/Bak, respectivamente. Estas proteínas atuam na membrana
externa da mitocôndria e são responsáveis pelo controle do fluxo de proteínas
apoptogênicas através de canais especializados. Esses canais regulam a saída
do citocromo c bem como de outras proteínas que são liberadas da mitocôndria
para o citosol (WEINBERG, 2008; ROSSÉ et al., 1998). O citocromo c fica
aprisionado no espaço intermembranar da mitocôndria, onde atua na
25
transferência de elétrons como parte da fosforilação oxidativa (HIRSCH et al,
1997; WEINBERG, 2008).
Durante o processo de apoptose, as moléculas de citocromo c são
liberadas para o citosol (HIRSCH et al., 1997) onde se associa a proteína Apaf-
1 (fator apoptótico ativado por protease), ATP e a procaspase 9 para formar um
complexo denominado apoptossomo (BUDIHARDJO et al, 1999; LI et al., 1997,
ACEHAN et al, 2002). Diferente das outras caspases, a procaspase 9 não é
ativada por uma simples clivagem, ela precisa estar ligada à Apaf-1 para ser
ativada (RODRIGUEZ & LAZEBNIK, 1999; STENNICKE et al., 1999; ZOU et
al., 1999;). O apoptossomo pode então recrutar a procaspase 3, que é clivada
e ativada pela caspase 9 ativa. A caspase 3 então ativa outras caspases
executoras constituindo uma cascata de sinalização que culmina com a
clivagem de vários substratos de morte tais como ICAD (inibidor de DNase
ativada por caspase), lâminas da superfície interna da membrana nuclear,
proteínas do citoesqueleto, como a actina, plectina e vimentina, que leva as
conhecidas mudanças morfológicas da apoptose ocorrendo a morte celular
(Figura 6) (WEINBERG, 2008; REED, 1997; LI et al., 1997).
Enquanto o citocromo c atua na ativação de caspases, outra proteína
conhecida como Smac/DIABLO que também é liberada da mitocôndria
juntamente com o citocromo c, atua inibindo um grupo de proteínas
antiapoptóticas chamadas de IAPs (inibidores de apoptose). Proteínas da
família IAP podem se ligar e inibir sítios ativos das caspases 3, 6 e 7,
bloqueando-as ou pela inibição da atividade proteolítica das caspases ou por
degradá-las. Entretanto, quando a Smac/DIABLO é liberada da mitocôndria, ela
é capaz de antagonizar esses IAPs protegendo as caspases da inibição por
essas moléculas, permitindo a continuidade do processo apoptótico (Figura 6).
(WEINBERG, 2008; EKERT et al., 2001; DU et al. 2000; SUZUKI et al., 2001;
VERHAGEN et al., 2000).
26
Figura 5: Esquema da via intrínseca da apoptose. Fonte: Weinberg, 2008
A via extrínseca é induzida por receptores de morte que estão
localizados na superfície da célula (VAN CRUCHTEN & VAN DEN BROECK,
2002). Tais receptores de morte pertencem a família dos receptores do fator de
necrose tumoral (TNFR) que incluem Fas, TNFR1, DR3, DR4 e DR5 (Figura 7)
27
(LOCKSLEY et al., 2001) e estão envolvidos na transdução de sinais que
resultam na morte celular (ZIMMERMANN et al., 2001).
Os ligantes dos receptores de morte são membros da família de
proteínas do fator de necrose tumoral (TNF), que inclui TNF-α, TRAIL e ligante
Fas (FasL). Uma vez ativados pela ligação de seus ligantes, os domínios de
morte desses receptores ligam-se e ativam uma proteína associada
denominada FADD (proteína de domínio de morte associado à Fas) no
citoplasma (CHINNAIYAN et al., 1995; CHINNAIYAN et al., 1996). O complexo
resultante é chamado DISC (complexo de sinalização indutor de morte) que
atua na conversão das procaspases iniciadoras (8 e/ou 10) em suas
respectivas caspases ativas através de clivagem autoproteolítica (Figura 7)
(DONEPUDI et al., 2003; WEINBERG, 2008). Após ativação das procaspases
8 e /ou 10 em suas caspases ativas, estas últimas convergem na cascata
apoptótica intrínseca clivando e ativando as caspases executoras (3, 6 e 7)
culminando assim com morte celular por apoptose (BUDIHARDJO et al, 1999;
WEINBERG, 2008).
28
Figura 6: Esquema da via extrínseca da apoptose. Fonte: Weinberg, 2008
Ao contrário da apoptose, a necrose tem sido considerada como uma
forma descontrolada de morte celular (BRUIN & MEDEMA, 2008), no entanto
trabalhos recentes sugerem que a necrose também pode ocorrer através de
uma morte celular programada (BURSCH et al., 2000; KIM, 2005). Esse
processo constitui uma forma de morte celular passiva e independente de
energia (PROSKURYAKOV et al., 2003). Os marcos desse tipo de morte
envolve alterações dramáticas na mitocôndria, incluindo despolarização
mitocondrial, depleção de ATP, geração de EROs (espécies reativas de
oxigênio), perda da homeostase de cálcio, além de causar vacuolização
citoplasmática, perda de integridade da membrana, inchaço da célula seguido
de lise completa, sem formações de vesículas, e desintegração das organelas.
29
O rompimento brusco da membrana plasmática causa extravasamento de
mediadores inflamatórios como citocinas e pirógenos desencadeando o
processo inflamatório (RODRIGUES et al., 2006; ZONG & THOMPSON, 2006;
LOURO et al., 2002). A necrose não é observada durante o processo normal
de eliminação celular, que ocorre durante o desenvolvimento e a homeostase
de tecidos normais (SCHWARTZ & OSBORNE, 1993). A necrose ocorre
tipicamente em grupos de células adjacentes expostas as mesmas condições
não fisiológicas, levando a uma amplificação da lesão ao tecido afetado
(DUVALL & WYLLIE, 1986).
ZONG & THOMPSON (2006) sugeriram que algumas formas de necrose
não são processos passivos, mas uma via bastante regulada, semelhante a
apoptose. Esse tipo de necrose estaria presente nas doenças
neurodegenerativas, doenças inflamatórias, infecções e câncer, bem como em
outros processos. Dentre as características morfológicas da necrose
programada estão a despolarização mitocondrial, ativação de proteases (não-
caspase), perda da homeostase de cálcio, depleção de ATP e geração de
espécies reativas de oxigênio (EROs).
1.3. Produtos naturais e a importância da síntese química
Os recursos naturais renováveis como plantas, microorganismos,
invertebrados e vertebrados, de uma forma geral, são fontes extremamente
importantes de compostos bioativos (MANN, 2002). E, apesar do interesse na
modelagem molecular, na química combinatória e outras técnicas de síntese
química pelas instituições de pesquisa e indústrias farmacêuticas, os produtos
naturais são uma importante fonte de novos agentes terapêuticos contra
doenças infecciosas, câncer, dislipidemias e imunomodulação (ROCHA et al.,
2001; NEWMAN et al., 2003; BUTLER, 2004). Em 1982, Hartwell listou mais de
3000 espécies de plantas que tinham sido usadas no tratamento de cânceres
(HARTWELL, 1982).
A importância da diversidade química dos produtos naturais e seus
derivados para a descoberta de novos fármacos têm despertado interesse da
30
indústria farmacêutica. Em 2005, a Sociedade Americana de Química destacou
uma lista de 46 fármacos que tiveram um enorme impacto na saúde, onde,
dentre estas 80% são compostos sintéticos, que vão desde a aspirina
®
(ácido
acetil salicílico), com estrutura química simples, sendo o analgésico mais
utilizado no mundo, ao taxol
®
(paclitaxel) com estrutura química complexa,
usado no tratamento de neoplasias, entre outros (DAEMMRICH & BOWDEN,
2005).
Nos últimos 50 anos, as pesquisas de novas moléculas levaram a
descoberta de mais de 100 novos fármacos que adentraram ao arsenal para o
tratamento de neoplasias malignas, sendo, na sua maioria, derivados ou
protótipos de produtos naturais (WAGNER-DÕBLER et al., 2002). O paclitaxel
(Taxol
®
), um diterpeno isolado inicialmente da Taxus brevifloria Nutt.
(Taxaceae) como agente citotóxico (KINGSTON, 1996; KINGSTON, 2005)
atuando como inibidor do crescimento celular impedindo a despolimerização
dos microtúbulos (BARREIRO & FRAGA, 2002), é um exemplo interessante
que demonstra a importância da síntese ou semi-síntese química na
descoberta de novos agentes anti-neoplásicos. Devido à dificuldade de
isolamento e baixo rendimento, somente após 20 anos de sua descoberta, o
Paclitaxel foi utilizado para testes clínicos. No entanto, para produzir 360g do
composto, cerca de 4000 árvores foram sacrificadas, tornando inviável seu uso
(MANN, 2002). Este problema somente foi solucionado quando Potier e seus
colaboradores descobriram que das folhagens de Taxus baccata poderia se
extrair uma quantidade maior de um precursor, 10-deacetilcaccatin III, que
facilmente poderia ser convertido em Paclitaxel e em análogos mais potentes
como o Docetaxel (Taxotere®) (GUERITTE-VOEGELIN et al., 1991). Este
último é um taxóide, semi-sintético, duas vezes mais potente que o composto
natural (Figura 8) (BARREIRO & FRAGA, 2002).
31
Figura 7: Estrutura do paclitaxel e seu análogo docetaxel
De fato, o melhor impacto de compostos isolados de plantas como
protótipo para novas drogas é percebido na área do tratamento de neoplasias
(NEWMAN et al., 2003). Neste aspecto, pode-se citar além do paclitaxel, a
vimblastina e vincristina (Catharanhtus roseus G. Don) com o análogo
vinorelbina e vindesina (Figura 8) (JOHNSON et al., 1996), Camptotecina
(Camptotheca acuminata Decne) com os análogos irinotecano e topotecano
(Figura 9), entre outros, todos usados no tratamento de diferentes tipos de
câncer (SCHWARTSMANN et al., 2002). O sucesso terapêutico dessas
substâncias estimula a procura de novos agentes quimioterápicos derivados de
produtos naturais mais ativos e com menos efeitos colaterais. Assim, há uma
maior probabilidade de se encontrar uma droga promissora no âmbito
terapêutico e/ou preventivo do câncer.
Figura 8: Estruturas da vimblastina e do seu derivado vindesina
32
Figura 9: Estruturas da camptotecina e dos derivados irinotecano e topotecano
Como dito anteriormente, os produtos naturais de uma forma direta ou
indiretamente constituem um potente arsenal na busca de novas drogas com
atividade antitumoral. Nesse contexto, as quinonas se apresentam como um
composto químico de grande interesse para indústria farmacêutica. Dentre as
várias quinonas utilizadas na terapia anticâncer podemos citar a
daunorrubicina, a doxorrubicina e a mitoxantrona (ASCHE, 2005) (Figura 10).
33
Figura 10: Estruturas quinonas utilizadas na terapia anticâncer
1.4. Quinonas
As quinonas representam uma importante classe de compostos de
ocorrência natural ou produto de síntese com uma grande variedade de
funções (THOMSON, 1987; ASCHE, 2005). O esqueleto quinona foi
identificado como um importante grupo farmacofórico para a atividade
citotóxica de vários compostos utilizados na clínica (DRISCOLL, et al, 1974;
LIU, et al., 2004), constituindo ainda uma das maiores classes de agentes anti-
tumorais (ASCHE, 2005).
As quinonas são compostos orgânicos que podem ser considerados
como produtos da oxidação de fenóis; da mesma forma, a redução de quinonas
pode também originar os correspondentes fenóis, sendo uma reação de dois
sentidos. Sua principal característica é a presença de dois grupos carbonílicos
34
que formam um sistema conjugado com pelo menos duas ligações duplas C-C.
Assim, em função do ciclo no qual o sistema de duplas e cetonas conjugadas
está inserido, têm-se os três grupos principais de quinonas: benzoquinonas –
um anel benzênico; naftoquinonas - um anel naftalênico; antraquinonas - um
anel antracênico (Figura 10) (SIMÕES et al., 2002).
Figura 11: Estruturas dos principais grupos de quinonas: benzoquinona (A),
naftoquinona (B) e antraquinona (C)
As quinonas representam uma ampla e variada família de metabólitos de
distribuição natural. Em estudos farmacológicos, as quinonas mostram variadas
atividades destacando-se, dentre outras, as propriedades microbicidas, anti-
inflamatórias e antitumorais (MONKS et al., 1992).
Drogas que possuem um grupamento quinona tais como antraquinonas
e mitoxantronas apresentam uma excelente atividade anti-neoplásica na clínica
oncológica, sendo bastante aceito que a citotoxicidade de quinonas esteja
relacionada à geração de espécies reativas de oxigênio, além da inibição da
enzima topoisomerase-II, levando a quebra da molécula de DNA (MATES &
SÁNCHEZ-JIMÉNEZ, 2000). No entanto, a contribuição exata da subestrutura
quinona para seu efeito antitumoral permanece incerta (ASCHE, 2005).
O lapachol e seus derivados estão associadas com numerosas
atividades biológicas como bactericida, fungicida, anti-malária,
tripanossomicida e antitumoral (GUIRAUD, et al., 1994; de ANDRADE-NETO,
et al., 2004; FERREIRA, et al., 2006; RAVELO, et al., 2004).
A β-lapachona (3,4-diidro-2,2-dimetil-2H-naftol [1,2-b] piran-5,6-diona) é
o derivado mais importante do lapachol com atividade antitumoral promissora
35
(Figura 12). β-lapachona é uma orto-naftoquinona naturalmente obtida de uma
árvore nativa da América do Sul, Tabebuia avellanedae (SCHAFFNER-SABBA,
1984). Este composto apresenta um amplo leque de atividades farmacológicas,
tais como atividades antibacteriana, antifúngica, tripanossomicida, anti-
retroviral e antiinflamatória (GUIRAUD et al., 1994; LOPES et al., 1978;
GOIJMAN & STOPPANI, 1985; SCHUERCH & WEHRLI, 1978, MANNA et al.,
1999). Além disso, a β-lapachona é um potente agente anticâncer, sendo
efetivo contra uma variedade de células tumorais humanas (LI et al., 1999a,
SCHAFFNER-SABBA, 1984; PLANCHON et al. 1995; 2001; PINK et al.,
2000a,b), inibindo até mesmo tumores resistentes a terapias convencionais
(Ough et al., 2005, LI et al., 1995, PLANCHON et al, 1995).
Figura 12: Estruturas do lapachol e da β-lapachona.
O mecanismo exato do efeito citotóxico desse composto permanece
desconhecido, no entanto, alguns estudos mostraram que a β-lapachona causa
parada em fases específicas do ciclo celular podendo levar à apoptose (LI et
al., 1993; PLANCHON et al., 1995; LI et al., 1995; LI et al., 1999b) ou à necrose
(LI et al., 1999b) dependendo da célula alvo, tempo e da dose testada
(WELLER et al., 1997). O processo de morte induzido por esta quinona é
independente de dano direto ao DNA (PARDEE, et al., 2002).
Suas atividades podem ser atribuídas a geração de espécies reativas de
oxigênio (EROs), que é conhecido por causar apoptose em células de leucemia
humana (PLANCHON et al., 1995; PINK et al., 2000b; TAGLIARINO et al.,
36
2001), desprogramar a síntese de DNA (KUMAR & HARVEY, 1995) e inibir
enzimas como topoisomerases I (LI et al., 1993) e II (FRYDMAN et al., 1997),
causar clivagem da poli (ADP-ribose) polimerase (PARP) e caspase 3 e
aumentar a atividade proteolítica da procaspase 9 (GUPTA et al 2002).
A geração de EROs intracelular é um processo inevitável e muitas vezes
fisiologicamente importantes (Skulachev, 1996). As EROs podem ser
produzidas durante a respiração celular na mitocôndria e por sistemas
enzimáticos distintos, incluindo aquelas dos peroxissomos e a oxidação
espontânea de lipídeos (KAMATA & HIRATA, 1999; WEINBERG, 2008).
Dentre as EROs liberadas da mitocôndria estão o íon superóxido (O
2
•–
), o
oxigênio singlet, o peróxido de hidrogênio (H
2
O
2
) e radicais hidroxilas (
•
OH)
como mostrado na reação abaixo (WEINBERG, 2008).
As EROs possuem papéis bastante controversos. Em situações de não
estresse elas atuam promovendo a proliferação celular, no entanto, na
presença de estresse, parecem ativar e modular a morte celular via apoptose
e/ou necrose. Segundo Jabs (1999), os níveis de EROs são aumentados em
células expostas a situações de estresse, incluindo o tratamento com drogas
anticâncer que irão promover a ativação de proteínas pró-apoptóticas,
induzindo a morte celular (BENHAR et al, 2001; DAVIS et al., 2001; TOBIUME
et al., 2001). As Eros também podem atuar diretamente na maquinaria
apoptótica por acelerar a despolarização mitocondrial e disfunção durante a
fase efetora da apoptose (JABS, 1999). Assim, a mitocôndria é a maior fonte
de EROs durante o curso da apoptose (CAI & JONES, 1999).
Um dos campos de pesquisa bastante explorado atualmente para o
tratamento de diversos tipos de câncer, consiste no desenvolvimento de novas
drogas que sejam capazes de promover a geração de EROS (VERMA, 2006;
RIDNOUR et al., 2006), tais como quinonas (KOVACIC & SOMANATHAN,
2006), compostos nitroaromáticos (TOCHER, 1997) e sais imino (KOVACIC &
BECVAR, 2000; KOVACIC & COOKSY, 2005). Estudos anteriores mostraram
que alguns tipos de câncer apresentam-se em um elevado estado de estresse
oxidativo, mesmo quando sua maquinaria antioxidante trabalha em capacidade
37
máxima. Alguns autores sugerem que em níveis mais elevados de EROs, as
células tumorais sofrem danos que podem levá-las à morte, enquanto que
células normais não são afetadas. Assim, compostos geradores de EROs
podem mostrar seletividade para alguns tipos de células tumorais (PELICANO
et al., 2004; GUPTE & MUMPER, 2007).
A enzima NAD(P)H: quinona oxirredutase (NQO1), uma flavoproteína
encontrada na maioria das células eucarióticas, é também chave para a ação
da β-lapachona (PINK, et al., 2000b). A NQO1 catalisa uma redução de dois
elétrons de quinonas, como β-lapachona ou menadiona, usando ou NADH ou
NADPH como doador de elétrons. As quinonas são diretamente reduzidas a
hidroquinonas pelo NQO1, evitando o seu estado intermediário (instável e
altamente reativo) de semiquinona. As semiquinonas são excelentes geradores
de radicais livres, iniciando o ciclo redox que resulta na geração de superóxidos
(Pink, et al., 2000 a,b). A redução da β-lapachona pela NQO1 aumenta sua
ação citotóxica, incluindo inibição do crescimento e apoptose. Essa enzima é
superexpressa em tumores de mama, cólon, pulmão e próstata (MALKINSON,
et al., 1992; MARIN, et al., 1997; OUGH, et al., 2005) o que torna o grupo
quinona assim como seus derivados, potentes agentes terapêuticos para esses
tipos de tumores (ASHWELL, et al., 2006). Entretanto, esse mecanismo não
parece ser exclusivo visto que também é observado a indução de apoptose
pela β-lapachona em células deficientes em NQO1, como células HL-60 e
MDA-MB-468 (PINK, et al., 2000b). Com isso, tem sido sugerido que a
atividade antitumoral da β-lapachona está relacionada a diferentes mecanismos
de ação dependendo do tipo de célula estudada.
Substâncias que promovam o estresse oxidativo produzindo EROs
diretamente nas células, inibindo o aparato antioxidativo (KONG & LILLEHEI,
1998), causando desequilíbrio no estado redox intracelular ou atuando como
catalisadores na toxicidade das EROs (FRY & JACOB, 2006) são bons
candidatos para o tratamento do câncer (HILLARD, et al., 2008).
A β-lapachona mostra grande seletividade por células tumorais, podendo
induzir apoptose em células transformadas, mas não em células com
38
proliferação normal. Propriedade esta atípica entre os agentes quimioterápicos
convencionais (LI, et al., 2003; CHAU, et al., 1998).
É sabido que a grande maioria dos quimioterápicos usados na prática
clínica, não possui especificidade para as células tumorais, levando a
toxicidade também para as células normais. As células com alta taxa de
proliferação como as das mucosas e cabelo, são uma das células mais
prejudicadas, desencadeando efeitos colaterais como mucosite e alopecia.
Assim, a indústria farmacêutica procura cada vez mais fármacos que sejam
mais eficazes e mais seletivos. A β-lapachona, diferente de muitas drogas
utilizadas na quimioterapia convencional, induz apoptose em células
transformadas, mas não em células com taxa de proliferação normal (LI, et al.,
2003; CHAU, et al., 1998).
Nesse âmbito, a remodelagem de compostos a partir da β-lapachona
pode aumentar a eficácia dessa classe de compostos e diminuir os seus efeitos
adversos. A nor- β-lapachona (composto 1) é um derivado da β-lapachona que
mostrou citotoxicidade em algumas linhagens de carcinoma humano, com CI
50
variando de 2 a 2,5µM (KONGKATHIP et al., 2003). Já o seu derivado
nitrofenilamino (composto 2) foi anteriormente descrito como um composto com
forte atividade citotóxica contra várias linhagens de células tumorais, após 72 h
de incubação, apresentando CI
50
abaixo de 1µg/mL (da SILVA Jr et al., 2007).
Neste contexto, o objetivo desse trabalho foi avaliar a atividade citotóxica
e o possível mecanismo de ação dos compostos 1 e 2.
39
Objetivos
40
2. OBJETIVOS
2.1. Objetivo Geral
O objetivo desse trabalho foi avaliar as propriedades citotóxicas da 2,2-
dimetil-3-(3-nitrofenilamino)-2,3-di-hidronafto [1,2-b] furan-4,5-diona (composto
2) e de seu protótipo (composto 1) em células leucêmicas humanas (HL-60),
visando avaliar o mecanismo de ação.
2.2. Objetivos Específicos
9 Determinar o potencial citotóxico in vitro dos compostos 1 e 2 em
linhagem leucêmica humana (HL-60) após 24 horas de exposição;
9 Determinar a seletividade dos compostos 1 e 2 utilizando células
mononucleares de sangue periférico de voluntários saudáveis;
9 Avaliar os possíveis mecanismos envolvidos na citotoxicidade induzida
pelos compostos 1 e 2 utilizando células leucêmicas (HL-60) após 24 horas de
incubação.
41
Materiais e
Métodos
42
3. MATERIAIS E MÉTODOS
3.1. Materiais utilizados
Os equipamentos, soluções, reagentes e fármacos utilizados estão
listados no anexo I.
3.2. Metodologia Experimental
3.2.1. Síntese das quinonas
O derivado nitrofenilamino da nor-β-lapachona (composto 2) foi
sintetizado (da SILVA Jr, 2007) e cedido pelo Prof. Dr. Vítor Francisco Ferreira
da Universidade Federal Fluminense e seu aluno Eufrânio Nunes da Silva
Júnior, em colaboração com a Prof
a
. Dr
a
Marília Oliveira Fonseca Goulart da
Universidade Federal de Alagoas. As amostras foram mantidas a - 20ºC em
soluções estoque de DMSO a 1mg/mL.
Figure 13: Estruturas dos compostos estudados: (1): 2,3-dihidro-2,2-dimetilnafto [1,2-
b] furan- 4,5-diona (nor-β-lapachona) e (2): 2,2-dimetil-3-(3-nitrofenilamino)-2,3-di-
hidronafto [1,2-b] furan-4,5-diona.
3.2.2. Estudo da atividade citotóxica
Cultivo da Linhagem tumoral
Células leucêmicas (HL-60) foram cultivadas em frascos plásticos para
cultura (Corning, 75 cm
2
, volume de 250 mL para células em suspensão);
utilizando o meio de cultura RPMI 1640 suplementado com 10% de soro fetal
bovino e 1% de antibióticos (penicilina/estreptomicina). As células foram
(1) (2)
43
incubadas em estufa a 37°C com atmosfera de 5% de CO
2
, seguido da
observação do crescimento celular com ajuda de microscópio de inversão a
cada 24 horas. (BUTLER & DAWSON, 1992).
3.2.2.1. Avaliação da atividade antiproliferativa em linhagens de células
tumorais in vitro - Teste do MTT.
Princípio do Teste
O ensaio consiste em uma análise colorimétrica baseada na conversão
do sal 3-(4,5-dimetil-2-tiazol)-2,5-difenil-2-H-brometo de tetrazólio (MTT) para
formazan, pela atividade da enzima succinil-desidrogenase presente na
mitocôndria da célula viável (MOSMANN, 1983), permitindo, dessa maneira,
quantificar a porcentagem de células vivas.
Procedimento Experimental
As células foram distribuídas em multiplacas de 96 cavidades numa
densidade de 3 x 10
5
células/mL. As substâncias testes foram incubadas
durante 21 horas juntamente com a suspensão de células. Após o período de
incubação, as placas foram centrifugadas (1500 rpm/15 min), e o sobrenadante
foi descartado. Cada cavidade recebeu 150 µL da solução de MTT (10% em
meio RPMI 1640) e foi reincubada durante 3 horas, em estufa a 37°C e a 5%
CO
2
. Após esse período, as placas foram novamente centrifugadas (3000
rpm/10 min), o sobrenadante foi desprezado, e o precipitado foi ressuspendido
em 150µL de DMSO para a quantificação do sal reduzido nas células vivas. As
absorbâncias foram lidas com o auxílio do espectrofotômetro de placa, no
comprimento de onda de 595 nm.
Análise dos Dados
Os experimentos foram analisados segundo suas médias e respectivos
erros-padrão. O gráfico absorbância x concentração foi registrado e
determinado a sua concentração inibitória média capaz de provocar 50% do
efeito máximo (CI
50
) e seus respectivos intervalos de confiança de 95% (IC
44
95%) realizado a partir de regressão não-linear no programa GraphPad Prism
Software versão 5.0.
3.2.2.2. Avaliação da atividade antiproliferativa em células mononucleares
de sangue humano periférico (CMSP) – Ensaio do Alamar Blue.
Princípio do Teste
Com o objetivo de estudar a seletividade dos compostos em estudo na
proliferação de células normais, o ensaio do alamar blue foi realizado com
célula mononucleares de sangue periférico (CMSP), que inclui linfócitos e
monócitos. O alamar blue, recentemente identificado como resazurina
(O'BRIEN et al., 2000), é um indicador fluorescente/colorimétrico, onde em sua
forma oxidada apresenta uma coloração azul (não fluorescente/célula não
viável) e em sua forma reduzida uma coloração rósea (fluorescente/célula
viável). Assim como o MTT, o alamar blue reduz-se em células vivas, e assim
pode ser quantificado e utilizado para avaliar a viabilidade celular (AHMED et al
1994).
Procedimento Experimental
As células mononucleares foram obtidas do sangue periférico de
voluntários sadios após centrifugação em gradiente de Ficoll. As células foram
removidas, lavadas com tampão fosfato e ressuspendidas em meio RPMI 1640
suplementado com 20% de soro fetal bovino, 100 U/mL penicilina, 100 μg/mL
estreptomicina para uma concentração final de final 3 x 10
5
células/mL.
Fitohemaglutinina (3%) foi adicionada para induzir a proliferação dos linfócitos.
Após 24 horas de incubação das células, as substâncias em estudo foram
adicionadas em concentrações seriadas juntamente com 10 µL da solução
estoque (0,312 mg/mL) de alamar blue e incubadas por 24 horas em estufa a
37°C com atmosfera de 5% de CO
2
e 95 % de umidade. A doxorrubicina foi
utilizada como controle positivo. Após o período de incubação as absorbâncias
foram medidas no espectrofotômetro de placa, no comprimento de onda de 570
nm (reduzido) e 595 nm (oxidado).
45
Análise dos Dados
A proliferação celular foi calculada utilizando a seguinte fórmula: %
proliferação = A
LW
– (A
HW
x R
0
) x 100. Onde, A
LW
e A
HW
são as absorbâncias no
menor e maior comprimento de onda, respectivamente. O R
0
foi calculado
utilizando a seguinte fórmula: R
0
=AO
LW
/AO
HW
. Onde, AO
LW
e AO
HW
são as
absorbâncias do meio adicionado ao alamar blue subtraído das absorbâncias
do meio isolado nos comprimentos de onda menor e maior, respectivamente. A
absorbância foi medida usando um leitor de multiplacas (DTX 880 Multimode
Detector, Beckman Coulter, Inc. Fullerton, Califórnia, EUA). O efeito da droga
foi quantificado como a porcentagem da absorbância controle a 570 nm e a 595
nm. Os compostos foram testados em diluição seriada, em duplicata ou
triplicata, e suas CI
50
(concentração inibitória média capaz de provocar 50% do
efeito máximo) e respectivos intervalos de confiança de 95% (IC 95%) foram
determinados a partir de regressão não-linear utilizando o programa Prism
versão 5.0 (GraphPad Software).
3.2.3. Estudo do Mecanismo de Ação em células leucêmicas (HL-60)
Células da linhagem HL-60, na concentração de 3 x 10
5
células/mL,
foram incubadas por 24 horas e examinadas ao microscópio óptico de
inversão. As concentrações das drogas utilizadas foram estimadas a partir do
valor da CI
50
do composto 2 encontrada no método do MTT para esta mesma
linhagem celular após incubação por 24 horas. Assim as concentrações
escolhidas foram de 1,0 e 2,0 µM para o composto 1 e 0,5; 1,0; 2,0 µM para o
composto 2. A doxorrubicina (0,5 µM) foi utilizada como controle positivo
(VERAS et al, 2004).
3.2.3.1. Teste de citotoxicidade in vitro – Viabilidade celular por Exclusão
do azul de tripan.
Princípio do Teste
O teste de exclusão por azul de tripan permite quantificar
separadamente as células viáveis das células mortas pela substância testada.
46
O corante penetra em todas as células, porém somente as células viáveis
conseguem bombear o tripan para fora, sendo possível dessa maneira,
observar uma coloração azulada nas células metabolicamente inativas (PERES
& CURI, 2005).
Procedimento Experimental
A uma alíquota de 90μL da suspensão de células foi adicionado 10μL do
azul de tripan. As células viáveis e as não viáveis foram diferenciadas e
contadas em câmara de Newbauer, contando-se as células de dois quadrantes
diagonalmente opostos. A Doxorrubicina (0,5 μM) foi usada como controle
positivo (VERAS et al, 2004).
Análise dos Dados
Os dados foram analisados a partir da média e do erro padrão da média
de 3 experimentos. Para verificação da ocorrência de diferenças significativas
entre os diferentes grupos, os dados foram comparados por análise de
variância (ANOVA) seguida do teste de Dunnet, com nível de significância de
5% (p<0,05).
3.2.3.2. Ensaio antiproliferativo - Incorporação do BrdU
Princípio do Teste
A bromodeoxiuridina (BrdU) é uma base nitrogenada análoga a timina.
Assim, quando as células estão sintetizando DNA o BrdU é incorporado no
lugar da timina. A detecção do BrdU incorporado nas células é feita por
técnicas imunohistoquímicas. O BrdU é adicionado 3 horas antes do término do
período de incubação, para que esse seja incorporado ao DNA das células em
mitose. Em seguida são adicionados os anticorpos e um cromógeno específico,
a diaminobenzidina (DAB). Para corar as células não marcadas pelo
cromógeno, utiliza-se hematoxilina (0,1%). São contadas as 200 (duzentas)
primeiras células observadas em microscópio óptico. Consideram-se positivas
47
para proliferação, as células de núcleo corado pelo DAB (cor marrom) e,
negativas, as células de núcleo corado com Hematoxilina (cor azul).
Procedimento Experimental
Três horas após a adição do BrdU na cultura de células HL-60 (3 x 10
5
células/mL), lâminas para cada amostra foram preparadas e postas para secar
por 2 horas. Após o período de secagem foram fixadas em metanol por 1
minuto. As células foram lavadas com tampão Tris (TBS) e incubadas em
solução desnaturante por 90 minutos a 70°C e pH 7,4. Após uma segunda
lavagem com TBS, as células foram circuladas com caneta hidrofóbica e
incubadas com anticorpo primário por 120 minutos em estufa bacteriológica. As
células foram incubadas com anticorpo secundário biotinado por 20 minutos e,
em seguida, com a solução de estreptavidina-fluoresceína por mais 20 minutos.
Foi adicionado o cromógeno DAB por aproximadamente 1 minuto e, em
seguida, removido com água destilada. A contra-coloração das células foi
realizada com hematoxilina (0,1%).
Análise dos Dados
Duzentas células foram contadas, diferenciando-as entre núcleo marrom
(incorporaram o BrdU) e não-marrom (não incorporam o BrdU). Os dados
foram expressos como da média ± E.P.M. de experimentos independentes (n =
2). A proporção de células marcadas em marrom e não-marcadas entre os
diferentes grupos foi comparada pelo teste ANOVA com nível de significância
de 5 % (p < 0,05) usando o programa GraphPad (Intuitive Software for Science,
San Diego, CA).
3.2.3.3. Análise morfológica - Coloração por May-Grunwald-Giemsa
Princípio do Teste
A coloração utilizada nesse experimento se baseia em interações
eletrostáticas entre os corantes e moléculas-alvo. Essa coloração possui azul
de metileno (corante básico), eosina (corante ácido), entre outros componentes
48
básicos que permite distinguir o citoplasma e o núcleo, sendo possível analisar
a célula quanto a sua integridade nuclear, bem como alterações no citoplasma.
Essa técnica é bastante indicada para estudo do padrão de morte celular
(apoptose/necrose).
Procedimento Experimental
Células da linhagem HL-60, plaqueadas na concentração de 3 x 10
5
células/mL foram incubadas por 24 horas com as drogas e examinadas ao
microscópio de inversão. Para observar a morfologia, 50μL da suspensão de
células foram adicionadas à centrífuga de lâmina (cytospin). Após a adesão
das células na lâmina, a fixação foi feita com metanol por 1 minuto e a
coloração por May-Grunwald, por 10 segundos, seguida pelo Giemsa por mais
10 segundos.
Análise dos Dados
As lâminas contendo as células coradas foram levadas ao microscópio
para avaliação das suas características morfológicas e comparadas ao controle
(não-tratadas). O registro das alterações celulares foi feito por fotografia em
microscopia optica.
3.2.3.4. Análise morfológica – Coloração diferencial por Laranja de
Acridina / Brometo de EtÍdio.
Princípio do Teste
O método de contagem diferencial laranja de acridina /brometo de etídio
permite diferenciar células viáveis daquelas em processo de morte por
apoptose ou necrose através da contagem diferencial por fluorescência com
base em alterações morfológicas nucleares e citoplasmáticas (MCGAHON et
al, 1995). Este método baseia-se na revelação das células (controle e tratadas)
com a coloração por brometo de etídio (BE) e laranja de acridina (LA) no
núcleo. A LA intercala-se ao DNA, conferindo aparência verde ao núcleo
49
celular, sendo capaz de atravessar membranas intactas. O brometo de etídio é
incorporado majoritariamente por células não viáveis (com instabilidade de
membrana), intercalando-se ao DNA corando-o de laranja; ligando-se
fracamente ao RNA, que se mostrará com uma coloração vermelha. As células
viáveis com membrana intacta apresentam núcleo uniformemente corado de
verde pela LA. O BE marca muito fracamente e às vezes não marca, pois não
atravessa a membrana íntegra. As células em apoptose inicial (membrana
ainda intacta) apresentam manchas verdes brilhantes no núcleo (condensação
da cromatina) e não são marcadas por BE. Podem ser observadas as
alterações da membrana em decorrência da formação de corpúsculos
apoptóticos. As células em necrose (lesão na membrana) apresentaram um
padrão de coloração uniforme, laranja-avermelhada e não há formação de
corpos apoptóticos (CURY-BOAVENTURA et al., 2003).
Procedimento Experimental
A suspensão de células controle ou tratadas com os compostos 1 e 2 foi
transferida para um tubo eppendorf e centrifugada por 5 min em baixa rotação.
O sobrenadante foi descartado e as células foram ressuspendidas em 20 μL de
solução de PBS. Em seguida, 1 μL da solução de LA/BE foi adicionado a cada
tubo e uma alíquota dessas células foi transferida para uma lâmina e montado
com lamínula para, em seguida, ser contada considerando cada evento celular
de interesse (GENG et al., 2003).
Análise dos Dados
Foram contadas 300 (trezentas) células, em duplicata, cada amostra
para quantificação percentual de cada evento celular (viáveis, necróticas e
apoptóticas). As lâminas foram montadas e fotografadas para registro visual
dos efeitos. Para verificação de ocorrência de diferenças significativas entre os
diferentes grupos, os dados foram comparados por análise de variância
(ANOVA) seguida por teste de Dunnett (p<0,05).
3.3. Citometria de Fluxo
50
A citometria de fluxo é uma técnica utilizada para se determinar
diferentes características das partículas biológicas. Os citômetros analisam as
células ou partículas em meio líquido que passam através de uma fonte de luz.
O desvio da luz, que está relacionado diretamente com a estrutura e morfologia
das células, e a fluorescência são determinados para cada partícula que passa
pela fonte de excitação. Após a aquisição do desvio da luz e fluorescência de
cada partícula, a informação resultante pode ser analisada utilizando-se um
computador com programa específico acoplado ao citômetro (SHAPIRO, 1995).
Para todos os compostos testados, cinco mil eventos foram avaliados
por experimento e os debris celulares foram omitidos da análise. A
fluorescência de células de HL-60 foram então determinadas por citômetro de
fluxo Guava EasyCyte Mine usando o software Guava Express Plus após 24
horas de incubação. Cinco mil eventos foram analisados para cada replicata
em três experimentos independentes.
3.3.1. Determinação da integridade da membrana celular - viabilidade
celular
Princípio do Teste
O teste baseia-se na capacidade do iodeto de propídeo penetrar nas
células cuja membrana esteja rompida e após a ligação ao DNA emitir alta
fluorescência quando é excitado pelo laser. As células com membrana íntegra
emitem baixa fluorescência (SHAPIRO, 1995).
Procedimento Experimental
Uma alíquota de 100µL de suspensão de células tratadas e não tratadas
foi incubada com 100µL de uma solução de PI a 50µg/mL (diluído em tampão
fosfato). Após 5 minutos as amostras foram analisadas por citômetria de fluxo.
Foram obtidas informações sobre morfologia celular (espalhamento frontal e
lateral da luz, o que corresponde ao tamanho e granulosidade relativa entre as
células, respectivamente) e integridade de membrana utilizando-se o filtro para
o espectro do vermelho (DARZYNKIEWICZ, et al., 1992).
51
3.3.2 Análise do ciclo celular e da fragmentação do DNA por citometria de
fluxo
Princípio do Teste
Esse teste baseia-se na capacidade do iodeto de propídeo ligar-se ao
DNA. Inicialmente a membrana plasmática das células foram lisadas por um
detergente, permitindo que o iodeto de propídeo (PI) ligue-se ao DNA de todas
as células. Células com o DNA íntegro emitirão alta fluorescência, já núcleos
com condensação da cromatina e DNA fragmentado incorporam menos PI e
por isso emitem menor fluorescência, sugestivo de apoptose. Além disso, o PI
consegue intercalar proporcionalmente a quantidade de DNA da célula,
podendo então mensurar as fases do ciclo celular, através da quantidade de
DNA presente em cada fase do ciclo celular.
Procedimento Experimental
Uma alíquota de 100µL de suspensão de células tratadas e não tratadas
foi incubada com 100µL de uma solução de lise (0,1% de citrato de sódio, 0,1
% de Triton X-100 e 2 μg/mL iodeto de propídio em PBS). Após um período de
30 minutos, onde os tubos permaneceram no escuro, as amostras foram
analisadas no citômetro de fluxo (NICOLETTI et al., 1991).
3.3.3 Determinação do potencial transmembrânico da mitocôndria por
citometria de fluxo.
Princípio do Teste
Esse teste baseia-se na capacidade da mitocôndria seqüestrar um
corante fluorescente, rodamina 123. Quando esta organela apresenta potencial
transmembrânico inalterado, as células que seqüestraram a rodamina emitem
alta fluorescência quando atingidas pelo laser. Alterações no potencial
mitocondrial transmembrânico levam ao efluxo da rodamina de dentro da
mitocôndria, gerando eventos que emitirão menor fluorescência comparado
com as células que possuem mitocôndrias normais.
52
Procedimento Experimental
Uma alíquota de 100µL de suspensão de células tratadas e não tratadas
foi incubada com 200µL de uma solução de solução de rodamina 1 μg/mL.
Após 15 minutos de incubação no escuro, as amostras foram centrifugadas a
2000rpm/5min. O sobrenadante foi então descartado e 100 µL de PBS foi
adicionado em cada amostra. Após um período de 30 minutos incubadas no
escuro, as amostras foram analisadas no citômetro de fluxo (CURY-
BOAVENTURA, et al., 2004).
Análise dos dados
Os dados foram analisados a partir da média e do erro padrão da média
de 3 experimentos independentes. Para verificação da ocorrência de diferenças
significativas entre os diferentes grupos, os dados foram comparados por
análise de variância (ANOVA) seguida por Teste de Dunnet, com nível de
significância de 5% (p < 0,05).
3.3.4. Determinação da Externalização da Fosfatidilserina – Anexina V
Princípio do Teste
Um dos principais processos que ocorrem na apoptose é a perda da
assimetria da membrana fosfolipídica com a translocação da fosfatidilserina da
membrana interna da bicamada lipídica para superfície celular. A
externalização da PS ainda continua como um processo não totalmente
conhecido, mas sabe-se que a externalização da fosfatidilserina funciona como
um sinal da célula para que os macrófagos as fagocitem, antes da perda da
integridade da membrana celular (VERMES et al., 1995).
Procedimento Experimental
A externalização da fosfatidilserina foi analizada por citometria de fluxo
após coloração da fosfatidilserina com a anexina V (VERMES et al., 1995). Foi
utilizado o kit Guava Nexin para determinar apoptose inicial e tardia. Células
foram lavadas duas vezes com PBS gelado e ressuspendidas em 135 μL de
53
PBS com 5 μL de 7-amino-actinomicina (7AAD) e 10 μL de anexina V
conjugada com ficoeritrina (PE). As células foram gentilmente agitadas e
incubadas por 20 minutos em temperatura ambiente (20–25°C) no escuro.
Posteriormente, as células foram analisadas por citometria de fluxo
(EasyCyte/Guava Technologies). Anexina V é uma proteína ligada a um
fosfolípideo que tem alta afinidade por PS. 7AAD, é um corante hidrofílico
impermeável em células intactas, e é utilizado como um indicador da
integridade da membrana celular. A fluorescência da anexina V conjugada com
a ficoeritrina foi mensurada por fluorescência amarela-583nm e o 7AAD na
fluorescência vermelha a 680nm. A percentagem de células viáveis e de
células apoptóticas inicial e tardia foi calculada.
Análise dos Dados
Os dados foram analisados a partir da média e do erro padrão da média
de 2 experimentos realizados em triplicata. Para verificação da ocorrência de
diferenças significativas entre os diferentes grupos, os dados foram
comparados por análise de variância (ANOVA) seguida por Teste de Dunnet,
com nível de significância de 5% (p < 0,05).
3.3.5. Determinação da geração de espécies reativas de oxigênio
intracelulares
Princípio do Teste
As espécies reativas de oxigênio intracelulares foram monitoradas
utilizando o diacetato de 2’7’-diclorohidrofluoresceina (H
2
-DCF-DA), que é
convertido em um produto altamente fluorescente denominado de
diclorofluoresceina (DCF) na presença de espécies reativas de oxigênio
intracelulares (LEBEL et al., 1992).
Procedimento Experimental
No final do tratamento de 1 e 3 horas com as amostras teste, as células
foram incubadas a 20 µM de H
2
-DCF-DA e mantidas a 37°C por 30 minutos no
54
escuro. Após terminar o período total de incubação as células foram
centrifugadas por duas vezes, lavadas e ressuspendidas em tampão PBS e
analisadas imediatamente utilizando citometria de fluxo com comprimento de
onda de excitação e emissão de 490 e 530 nm, respectivamente. PMA (Forbol-
12-miristato-13-acetato) foi utilizado como controle positivo.
Análise dos dados
Em cada experimento foram contados 5000 eventos. Os dados foram
expressos como a média ± erro padrão da média de três experimentos
independentes realizados em triplicata. Para verificação da ocorrência de
diferenças significativas entre os diferentes grupos, os dados foram
comparados por análise de variância (ANOVA) seguida por Teste de Dunnet,
com nível de significância de 5% (p < 0,05).
55
Resultados
56
4- RESULTADOS
4.1. Atividade citotóxica pelo ensaio do MTT e ensaio de seletividade pelo
método do Alamar blue
Inicialmente, foi determinado o efeito citotóxico dos compostos 1 e 2
sobre o crescimento de células leucêmicas (HL-60) e em células
mononucleares de sangue periférico, de voluntários saudáveis. As CI
50
,
determinadas após 24 horas de exposição com as substâncias estão
representadas na tabela 1.
Como apresentado na tabela 1, ambos os compostos testados exibiram
forte efeito inibitório na proliferação das células HL-60 após 24 horas de
incubação. Baseado nos dados obtidos de dois experimentos independentes
realizados em duplicata, os valores de CI
50
dos compostos 2 e 1 foram de 0,48
µM e 2,92 µM, respectivamente, mostrando que o composto 2 apresentou
atividade mais potente que o composto 1 (Tabela 1). Para verificar a
seletividade dos compostos testados sobre as células tumorais, foi realizado o
ensaio do alamar blue com células mononucleares de sangue periférico
(CMSP). O composto 1 apresentou maior seletividade para células tumorais
quando comparada ao seu derivado nitrofenilamino (Tabela 1), mostrando que
a modificação estrutural do composto 1 com a adição do radical nitrofenilamino
na posição 3 aumenta a atividade citotóxica em ambas células tumorais e
normais.
57
Tabela 1: Efeito dos compostos 1 e 2 na citotoxicidade de células leucêmicas (HL-60)
e normais (CMSP) após 24 horas de incubação, respectivamente. Os resultados são
apresentados em valores de CI
50
com um intervalo de confiança de 95% obtido por
regressão não-linear a partir de três experimentos independentes, feitos em duplicata.
MTT
(HL-60)
Alamar blue
(CMSP)
Compostos
CI
50
μg/mL (μM) CI
50
μg/mL (μM)
Composto 1
0,84 (2,92)
(0,73 - 0,97)
> 5 (17,38)
Composto 2
0,17 (0,48)
(0,15 - 0,20)
1,07 (3,02)
(0,88 – 1,31)
Doxorrubicina
0,3 (0,5)
(0,2 - 0,4)
> 5 (8,3)
4.2. Mecanismo de ação envolvido na citotoxicidade dos compostos 1 e 2
A fim de investigar os possíveis mecanismos envolvidos na
citotoxicidade dos compostos 1 e 2, células HL-60 foram usadas como modelo.
As concentrações testadas foram baseadas nos valores de CI
50
do composto 2
após 24 horas de incubação. A doxorrubicina (D) na concentração de 0,5 µM
foi utilizada como controle positivo.
4.2.1. Viabilidade celular pelo método de exclusão por azul de tripan
Como dito anteriormente, esse ensaio é um método direto de avaliação
do potencial citotóxico de substâncias. A análise da viabilidade celular na
linhagem leucêmica HL-60 por exclusão de azul de tripan, após 24 horas de
exposição, demonstrou que o composto 2, nas maiores concentrações testadas
(1,0 e 2,0 µM), reduziu significativamente o número de células viáveis quando
comparadas ao controle negativo. Apenas na concentração de 2,0 µM foi
observado um pequeno aumento no número de células não-viáveis. Já o
composto 1 não apresentou alterações significativas quando comparadas ao
controle negativo. A doxorrubicina, utilizada como controle positivo, diminuiu
58
consideravelmente o número de células viáveis, aumentando discretamente o
número de células não-viáveis (Figura 14).
0
20
40
60
80
Composto 1 Composto 2
*
*
*
*
*
(μM)
Células viáveis Células não viáveis
Controle Dox
1,0
1,0 2,0
2,00,5
Número de células
(x 10
4
céls/mL)
Figura 14: Efeito dos compostos 1 e 2 na viabilidade de células leucêmicas HL-60
determinado por exclusão de azul de tripan depois de 24 horas de incubação. O
controle negativo (Controle) foi tratado apenas com o veículo utilizado para a diluição
da substância (DMSO). A doxorrubicina (0,5 μM) foi utilizada como controle positivo
(Dox). Os dados correspondem a média ± E.P.M. de experimentos independentes (n =
3).
*
p < 0,05 comparado ao controle por ANOVA, seguida de Dunnett.
4.2.2. Inibição da proliferação celular através da incorporação de BrdU
Para relacionar a atividade antiproliferativa dos compostos testados à
inibição da síntese de DNA foi realizado o ensaio de incorporação do BrdU.
Neste ensaio foi observado que células HL-60 tratadas com o derivado
nitrofenilamino (composto 2) , na maior concentração (2µM), foi capaz de inibir
cerca de 30% a proliferação celular, como mensurado pela incorporação do
BrdU após 24 horas de incubação (p < 0,05). Já as células tratadas com o seu
protótipo, composto 1 (2,0 µM), não mostraram diferença estatística quando
comparadas ao controle negativo. A doxorrubicina, utilizada como controle
positivo, causou 33% de inibição da proliferação celular (Tabela 2).
59
Tabela 2: Efeitos dos compostos 1 e 2 sobre a incorporação do BrdU expresso em
porcentagem do número de células, avaliada através da incorporação do 5-bromo-2´-
deoxyuridina (BrdU) em células leucêmicas HL-60 após 24 horas de incubação. O
controle negativo (C) foi tratado apenas com o veículo utilizado para a diluição da
substância (DMSO). Doxorrubicina (0,5μM) foi usado como controle positivo. Os dados
correspondem à média ± E.P.M. de experimentos independentes (n = 2).
*
p < 0,05,
ANOVA, seguida de Dunnett.
Compostos Concentração (µM) BrdU positivo (%) T/C
Controle - 56,71 -
Doxorrubicina 0,5 38,17* 0,67
Composto 1 2,0 53,50 0,94
0,5 57,00 1,0
1,0 49,00 0,86
Composto 2
2,0 39,75* 0,7
4.3. Análise das mudanças morfológica
4.3.1. Coloração diferencial por May-Grunwald-Giemsa
A análise por microscopia de luz das células HL-60, coradas com May-
Grunwald-Giemsa, revelou diversas mudanças morfológicas induzidas pelas
drogas. Após 24 horas em cultura, células HL-60 do grupo do controle (não-
tratadas) exibiram uma morfologia típica de células não aderidas, tais como
membrana íntegra, células pleiomórficas, nítida visualização tanto da
membrana plasmática quanto nuclear (Figura 15 A). As células tratadas com o
protótipo, composto 1, nas concentrações de 1,0 e 2,0 µM, assim como as
células tratadas com a menor concentração do composto 2 (0,5 µM) não
apresentaram mudanças morfológicas quando comparadas ao controle
negativo (Figuras 15 C, 15 D e 15 E). Por outro lado, células tratada com o
composto 2, nas concentrações de 1,0 e 2,0 µM, apresentaram morfologia
consistente com células em processo de apoptose, incluindo redução do
volume celular, condensação da cromatina e fragmentação nuclear (Figuras 15
F e 15 G). Na maior concentração testada (2,0 µM), o composto 2 também
60
levou ao aparecimento de características de necrose, como eosinofilia e perda
da integridade de membrana (Figura 15 G). A doxorrubicina (0,5µM), utilizada
como controle positivo, induziu redução do volume celular, condensação da
cromatina e fragmentação nuclear em células de HL-60, todas as
características condizentes com apoptose (Figura 15 B).
Figura 15: Análise morfológica de células da linhagem HL-60 (leucemia) após 24 horas de
incubação, coradas por May-Grunwald-Giemsa e visualizadas por microscopia óptica. (A):
controle negativo tratado apenas com o veículo utilizado para diluir as substâncias. (C) e (D):
células tratadas com o composto 1 nas concentrações de 0,5 µM, 1,0µM e 2,0µM,
respectivamente. (E), (F) e (G): células tratadas com o composto 2 nas concentrações 1,0µM e
2,0µM, respectivamente. (B): controle positivo tratado com doxorrubicina (0,5µM).
4.3.2. Coloração diferencial por Laranja de Acridina / Brometo de Etídio
Para confirmar que a atividade antiproliferativa dos compostos testados
está relacionada a indução de apoptose e necrose, a análise morfológica das
61
células tratadas foi investigada utilizando a coloração diferencial de laranja de
acridina e brometo de etídio (LA/BE) por microscopia de fluorescência. O
percentual de células viáveis, apoptóticas e necróticas foi então calculado.
Células viáveis, com coloração verde uniforme e morfologia normal, foram
observadas em células HL-60 do grupo controle, atingindo mais de 85% das
células contadas. O tratamento das células com o composto 1, em ambas as
concentrações testadas, não causou alterações significativas no padrão
morfológico de células HL-60 quando comparadas ao controle negativo. No
entanto, na concentração intermediária do composto 2 (1,0 µM) foi observado
um aumento de 19,1% na porcentagem de células em processo de apoptose
(Figura 16). Já na maior concentração (2,0 µM) o composto 2 causou uma
redução da porcentagem de células viáveis para 61,33% (p < 0,05). Essa
redução foi acompanhada por um aumento de 36,17% de células com
características de apoptose e apenas um discreto aumento de 2,5% de células
em necrose. Já a doxorrubicina causou 82,17% de apoptose, diminuindo
drasticamente o percentual de células viáveis (Figura 16).
Figura 16: Efeito do composto 1 e seu derivado nitrofenilamino (composto 2) na
viabilidade de células leucêmicas HL-60 coradas com Laranja de acridina/Brometo de
etídeo determinado por microscopia de fluorescência após 24 horas de incubação. O
controle negativo (Controle) foi tratado com o veículo utilizado para diluir as
substâncias testadas. Doxorrubicina (0,5µM) foi utilizada como controle positivo (Dox).
*p < 0,05. Os dados foram comparados por análise de variância (ANOVA) seguida por
Teste de Dunnet.
62
4.4. Análises da citometria de fluxo
4.4.1. Integridade de membrana celular e concentração de células
determinada por citometria de fluxo
A integridade da membrana celular e a concentração de células foram
determinadas por citometria de fluxo após 24 horas de incubação com as
amostras teste utilizando iodeto de propídio.
Como observado na figura 17, ambos os compostos causaram
diminuição na concentração de células de maneira dose-dependente.
Figura 17: Efeito dos compostos 1 e 2 sobre a densidade de células leucêmicas HL-
60, analisado por citometria de fluxo utilizando iodeto de propídeo, após 24 horas de
incubação. O controle negativo (Controle) foi tratado com o veículo utilizado para diluir
as substâncias testadas. Doxorrubicina (0,5µM) foi utilizada como controle positivo
(Dox). Os dados correspondem à média ± E.P.M. de três experimentos independentes.
Cinco mil eventos foram contados em cada experimento. *, p < 0,05 comparado com o
controle negativo por ANOVA seguido pelo teste de Dunnett.
Entretanto, na avaliação da integridade de membrana utilizando iodeto
de propídeo, corante hidrofílico permeável somente em células com membrana
rompida, mostrou que somente na maior concentração do composto o
composto 2 (2,0µM) houve uma pequena perda na integridade da membrana
celular (Figura 18). Esses dados confirmam os resultados observados através
63
dos testes de MTT, viabilidade por exclusão do azul de tripan, incorporação de
BrdU e coloração por May-Grunwald-Giemsa e LA/BE. Células tratadas com o
composto 1 e com o controle positivo (doxorrubicina) não apresentaram
diferenças estatísticas quando comparadas ao controle negativo (Figura 18).
Figura 18: Efeito dos compostos 1 e 2 sobre a integridade de membrana de células
leucêmicas HL-60, analisado por citometria de fluxo utilizando iodeto de propídeo,
após 24 horas de incubação. O controle negativo (Controle) foi tratado com o veículo
utilizado para diluir as substâncias testadas. Doxorrubicina (0,5µM) foi utilizada como
controle positivo (Dox). Os dados correspondem à média ± E.P.M. de três
experimentos independentes. Cinco mil eventos foram contados em cada experimento.
*, p < 0,05 comparado com o controle negativo por ANOVA seguido pelo teste de
Dunnett.
4.4.2. Análise do ciclo celular e da fragmentação de DNA determinada por
citometria de fluxo
A progressão do ciclo celular e a fragmentação internucleossomal do
DNA das células HL-60, tratadas com os compostos 1 e 2, foram realizadas por
citometria de fluxo e analisadas através do programa ModFit LT 3.1. Os
resultados mostraram que tanto o controle positivo (doxorrubicina) quanto as
duas maiores concentrações do composto 2 causaram aumento significante na
fragmentação de DNA (p < 0,05). Após 24 horas de exposição, células não
tratadas apresentaram 18,9% de fragmentação, enquanto as células tratadas
com o composto 2 nas concentrações de 1,0 µM e 2,0 µM causaram 47,2% e
83,5% de fragmentação de DNA, respectivamente. O composto 1, em ambas
64
as concentrações testadas, não causou fragmentação significativa do DNA. Já
a doxorrubicina (Dox), utilizada como controle positivo, mostrou 94,2% das
células com DNA fragmentado (Figura 19).
Figura 19: Efeito dos compostos 1 e 2 sobre a fragmentação de DNA de células
leucêmicas de HL-60, analisado por citometria de fluxo utilizando iodeto de propídeo,
após 24 horas de incubação. O controle negativo (Controle) foi tratado com o veículo
utilizado para diluir as substâncias testadas. Doxorrubicina (0,5µM) foi utilizada como
controle positivo (Dox). Os dados correspondem à média ± E.P.M. de três
experimentes independentes. Cinco mil eventos foram contados em cada experimento.
*, p < 0,05 comparado com o controle negativo por ANOVA seguido pelo teste de
Dunnett.
Quanto à progressão das fases do ciclo celular, nenhum dos compostos
testados interferiu no ciclo celular, sugerindo um mecanismo ciclo-
independente. Pôde-se observar uma tendência de diminuição da fase G2/M
nas células tratadas com a maior concentração do composto 2, no entanto não
foi estatisticamente significante (Figura 20). A doxorrubicina, utilizada como
controle positivo, reduziu da porcentagem de células em G2/M (Figura 20).
65
Figura 20: Efeito dos compostos 1 e 2 sobre a distribuição do ciclo celular em células
leucêmicas (HL-60) determinado por citometria de fluxo utilizando iodeto de propídeo,
após 24 horas de incubação. O controle negativo (Controle) foi tratado com o veículo
utilizado para diluir as substâncias testadas. Doxorrubicina (0,5µM) foi utilizada como
controle positivo (Dox). Os dados correspondem à média ± E.P.M. de três
experimentes independentes. Cinco mil eventos foram contados em cada experimento.
*, p < 0,05 comparado com o controle negativo por ANOVA seguido pelo teste de
Dunnett.
4.4.3. Determinação do Potencial Transmembrânico de Mitocôndria
Para avaliar o papel da mitocôndria na apoptose induzida pelos
compostos testados, a capacidade de induzir alterações no potencial da
transmembrana da mitocôndria (ΔΨm) foi avaliada. Como observado na figura
21, o controle positivo (Dox) e o composto 2, nas concentrações de 1,0 e 2,0
μM, induziram despolarização mitocondrial em células de HL-60, como
mensurado pela incorporação da Rodamina 123 usando citometria de fluxo.
Células tratadas com o composto 2, nas concentrações de 1,0 e 2,0 μM,
apresentaram 21,71% e 33,94% de despolarização mitocondrial,
respectivamente, enquanto que o controle negativo apresentou apenas 7,45%.
Por outro lado, o composto 1 não apresentou efeito significativo quando
comparado ao controle negativo (Figura 21). A doxorrubicina, utilizada como
controle positivo, causou 74,86% de despolarização mitocondrial (Figura 21).
66
Figura 21: Efeito dos compostos 1 e 2 sobre o potencial transmembrânico em células
HL-60 determinado por citometria de fluxo utilizando rodamina 123, após 24 horas de
incubação (H). (A): controle negativo tratado apenas com o veículo utilizado para diluir
as substâncias. (C) e (D): células tratadas com o composto 1 nas concentrações de
0,5 µM, 1,0µM e 2,0µM, respectivamente. (E), (F) e (G): células tratadas com o
composto 2 nas concentrações 1,0µM e 2,0µM, respectivamente. (B): controle positivo
tratado com doxorrubicina (0,5µM). Os dados correspondem à média ± E.P.M. de três
experimentes independentes. Cinco mil eventos foram contados em cada experimento.
*, p < 0,05 comparado com o controle negativo por ANOVA seguido pelo teste de
Dunnett.
4.4.4. Determinação da Externalização da fosfatidilserina
A fim de confirmar o tipo de morte celular induzida pelo composto 2 e
pelo seu protótipo (composto 1), a externalização da fosfatidilserina foi avaliada
por citometria de fluxo. Como observado na figura 22, ambos os compostos
testados reduziram a porcentagem de células viáveis e aumentaram o
percentual de células em apoptose inicial e tardia, no entanto, somente o
67
composto 2 aumentou o percentual de células em processo tardio de necrose.
Já a doxorrubicina (Dox) apresentou aumento significativo na porcentagem de
células em apoptose inicial e um pequeno aumento de células com apoptose
tardia (Figura 22).
Figura 22: Efeito dos compostos 1 e 2, na concentração de 2,0µM sobre a
externalização da fosfatidilserina em células leucêmicas (HL-60) determinado por
citometria de fluxo utilizando Anexina V-PE e 7-AAD, após 24 horas de incubação (E).
O controle negativo (A) foi tratado com o veículo utilizado para diluir as substâncias
testadas. Doxorrubicina (0,5µM) foi utilizada como controle positivo (B). Compostos 1 e
2 na concentração de 2 µM (C) e (D), respectivamente. Os dados correspondem à
média ± E.P.M. de três experimentes independentes. Cinco mil eventos foram
contados em cada experimento. *, p < 0,05 comparado com o controle negativo por
ANOVA seguido pelo teste de Dunnett.
4.4.5. Determinação da geração de espécies reativas de oxigênio
A produção intracelular de espécies reativas de oxigênio (EROs) foi
determinada por citometria de fluxo utilizando o corante fluorescente diacetato
de 2,7-diclorodihidrofluoresceína (H
2
-DCF-DA) após 1 e 3 horas de incubação
com as amostras teste. Como observado na figura 23, em ambos os tempos,
tanto o composto 1 quanto o composto 2 induziram a produção de EROs em
68
células HL-60. Essa geração de EROs aumentou de maneira dose-dependente
e foi reduzida de maneira tempo-dependente (Figura 23). Assim a produção de
EROs na primeira hora de incubação foi bem maior que após 3 horas de
exposição, sugerindo que os efeitos pró-apoptóticos do composto 2 observado
em todos os testes já descritos pode ser causado por um rápido estresse
oxidativo, levando as células a morte por apoptose seguida por necrose.
Figura 23: Efeito dos compostos 1 e 2 sobre a geração de EROs em células
leucêmicas (HL-60) determinado por citometria de fluxo utilizando H
2
-DCF-DA, após 1
e 3 horas de incubação. O controle negativo (C) foi tratado com o veículo utilizado
para diluir as substâncias testadas. PMA (1,0 µM) foi utilizado como controle positivo.
Os dados correspondem à média ± E.P.M. de três experimentes independentes. Cinco
mil eventos foram contados em cada experimento. *, p < 0,05 comparado com o
controle negativo por ANOVA seguido pelo teste de Dunnett.
69
Discussão
70
5. DISCUSSÃO
Os agentes anticâncer são, em grande parte, obtidos direta ou
indiretamente de produtos naturais, e atuam na inibição do crescimento de
células tumorais (CRAGG et al., 2005; NEWMAN et al., 2003). Estes agentes
não precisam ser necessariamente o melhor composto para o uso farmacêutico
(KINGSTON, 1996), podendo ser utilizados como protótipos para a síntese de
análogos mais promissores. A obtenção de análogos é um processo
comumente utilizado para descobrir os grupamentos essenciais à atividade
biológica, e isso pode ser feito através de estudos da relação entre a estrutura
e atividade biológica servindo de base para a otimização molecular (GARRETT
& WORKMAN, 1999; WILSON & DANISHEFSKY, 2007). Neste processo, tem-
se por objetivo o desenho racional e o desenvolvimento de uma segunda
geração de agentes com características melhoradas, tais como o aumento da
eficácia e da estabilidade, a melhora das propriedades farmacocinéticas e a
diminuição dos efeitos colaterais (ORTHOLAND & GANESAN, 2004).
As quinonas representam uma ampla e variada família de metabólitos de
distribuição natural ou produto de síntese com uma grande variedade de
funções em sistemas biológicos (ASCHE, 2005). Esses são de interesse tanto
farmacológico quanto toxicológico uma vez que vários fármacos clinicamente
importantes na terapia do câncer contêm o núcleo quinona (como as
antraciclinas, mitoxantrona e saintopina) apresentando excelente atividade
anticâncer (FOYE, 1995; MONKS & JONES, 2002). Nos últimos anos
intensificou-se o interesse nestas substâncias, não só devido à sua importância
nos processos bioquímicos vitais, como também ao destaque cada vez maior
que apresentam em variados estudos farmacológicos (SILVA et al., 2003).
Muitos análogos estruturalmente relacionados às naftoquinonas de
origem natural e sintética, tais como plumbagina, lapachol, menadiona e seus
derivados, estão sendo estudados devido ao seu potencial anticâncer contra
várias linhagens de células tumorais in vitro e in vivo (NOTO et al., 1989; NGO
et al., 1991; SRINIVAS et al., 2004; HSU et al., 2006; ESTEVES-SOUZA et al.,
2007). Dentre as naftoquinonas com potencial citotóxico, a β-lapachona tem
71
sido uma das mais estudadas nos últimos anos (da SILVA Jr et al., 2007),
sendo que as implicações mais importantes desse composto estão
relacionadas à sua atividade citotóxica contra várias linhagens de células
tumorais humanas e baixa citotoxicidade para células normais, indicando que a
β-lapachona atua seletivamente em células tumorais. (LI et al., 2000; PARDEE
et al., 2002; LI et al., 2003; da SILVA Jr et al., 2007). A nor-β-lapachona
(composto 1), derivada da β-lapachona, também possui potencial anticâncer
(KONGKATHIP et al., 2003; da SILVA Jr et al., 2007) e vários derivados
arilaminos da nor-β-lapachona têm sido descritos, apresentando forte atividade
citotóxica contra diversas linhagens de células tumorais humanas (da SILVA Jr
et al., 2007). Desse modo, o presente trabalho teve como objetivo investigar o
mecanismo citotóxico do composto 1 e de seu derivado nitrofenilamino
(composto 2) em células leucêmicas HL-60 após 24 horas de exposição.
Inicialmente, a CI
50
dos compostos em estudo foram determinadas
através do ensaio do MTT, após 24 horas de incubação. Como dito
anteriormente, os compostos 1 e 2 mostraram potencial citotóxico contra várias
linhagens de células tumorais humanas. Em células HL-60, após 72 horas de
incubação, os compostos 1 e 2 apresentaram CI
50
de 1,75 µM e 0,33 µM,
respectivamente (da SILVA Jr et al. 2007). Nossos resultados mostraram que
essa atividade pode ser observada já com 24 horas de exposição, onde os
compostos 1 e 2 apresentaram CI
50
de 2,92 µM e 0,48 µM, respectivamente,
sem necessariamente alterar significativamente os valores da CI
50
observados
por Silva Jr e colaboradores (2007) para 72 horas. Alguns trabalhos sugerem
que a incorporação de esqueletos ariloaminos, arilotióis ou halogenados em
quinonas contribuem para a melhoria da eficácia biológica (TANDON, et al.,
2004; RYU, et al., 2003), o que foi condizente com nosso trabalho (Tabela 1).
Muitos fármacos atualmente utilizados no tratamento do câncer agem
inibindo a progressão do ciclo celular, e como conseqüência inibem a
proliferação celular (ANAZETTI et al., 2003). Um dos grandes problemas
evidenciados no tratamento do câncer, utilizando quimioterápicos, são os seus
efeitos colaterais. Grande parte desses efeitos deve-se, principalmente, a
baixa seletividade desses fármacos por células tumorais, onde as células
72
normais mais afetadas são as que se proliferam rapidamente, como as células
da pele, do trato gastrintestinal e do sangue (ANAZETTI et al., 2003). Assim, a
busca por novos quimioterápicos tem como objetivo principal aumentar a
seletividade e a efetividade dessas substâncias, procurando eliminar apenas as
células tumorais e preservando as células normais.
Ao considerar os efeitos colaterais da quimioterapia, é de grande
importância verificar se a droga teste causa danos a células que estão se
dividindo normalmente, tais como linfócitos (ZUCO et al., 2002; ANAZETTI et
al., 2003). Desse modo, células mononucleares de sangue periférico de
voluntários saudáveis foram utilizadas para avaliar a seletividade os compostos
1 e 2 para células tumorais. Como observado, o composto 1 mostrou forte
seletividade para as células tumorais, o que também foi observado em células
mononucleares de sangue periférico (CMSP) estimulado por fitohemaglutinina
tratadas com β-lapachona (LI et al., 2003). No entanto, a presença do radical
nitrofenilamino inibiu parcialmente essa seletividade, apresentando CI
50
aproximadamente seis vezes maior quando comparado a CI
50
em células de
HL-60, no mesmo período de exposição.
Os testes antiproliferativos de exclusão por azul de tripan (Figura 14) e
inibição da incorporação do BrdU (Tabela 2) corroboraram com o ensaio do
MTT (Tabela 1), onde o composto 2 apresentou maior atividade antiproliferativa
que seu protótipo (composto 1) nas concentrações testadas. A atividade
antiproliferativa mensurada pela incorporação do BrdU mostrou que o
composto 2 age de maneira dose-dependente sugerindo que o mecanismo de
ação envolvido na citotoxicidade desse composto está relacionado à inibição
da proliferação celular que foi mensurada pela inibição da síntese de DNA.
Muitas substâncias utilizadas na terapia do câncer apresentam essa
característica, onde o seu derivado apresenta maior atividade, como o
etoposídeo que foi obtido da modificação estrutural do principal constituinte da
Podophyllum peltada, a podofilotoxina. Esta última apresenta atividade
citostática moderada, enquanto seu análogo, etoposídeo, possui efeitos anti-
câncer (Chen et al., 1984).
73
Drogas que induzem morte celular por apoptose em linhagens de células
tumorais podem ser úteis na quimioterapia (ZAMAI et al., 2001; LOS et al.,
2003; BRADY, 2004). Apoptose é uma forma de morte celular de fundamental
importância em vários sistemas biológicos, pois desempenha um papel
essencial no desenvolvimento dos tecidos e órgãos, na regulação da resposta
imune, na eliminação de células senescentes e na morte celular induzida por
quimioterápicos (HU & KAVANAGH, 2003; VERMEULEN et al., 2005). A morte
celular via apoptose pode ser identificada por uma série de alterações
morfológicas na célula como diminuição do volume celular, condensação da
cromatina, fragmentação nuclear, formação de corpos apoptóticos e de
prolongamentos da membrana plasmática (“blebs”). Já a necrose ocorre por
uma ação rápida da droga na célula e é caracterizada pelo aumento do volume
celular inicial e perda da integridade da membrana plasmática (KERR et al.,
1972; DARZYNKIEWICZ et al., 1992; STRASSER et al, 2000).
As células em apoptose mantêm suas membranas íntegras durante
quase todo o processo até a sua morte, diferentemente daquelas necróticas.
Confirmando os resultados do MTT e do teste de exclusão por azul de tripan,
os compostos 1 e 2 reduziram significantemente a concentração de células de
maneira dose-dependente. Na análise da integridade de membrana, somente
as células tratadas com 2,0 µM do composto 2 sofreram perda da integridade
de membrana, dados estes que corroboram com os resultados obtidos pelo
colorações por May-Grunwald Giemsa e LA/BE.
Vários estudos demonstraram que β-lapachona induz apoptose em
diferentes tipos de células (PLANCHON et al., 1995; HUANG & PARDEE,
1999; LEE et al., 2006; LIEN et al., 2008; SHAH et al., 2008). Essa quinona é
descrita por induzir seletivamente apoptose em células transformadas, mas não
em células de proliferação normal. Propriedade essa distinta e não
compartilhada com os demais agentes quimioterápicos convencionais (LI et al.,
2003). Dessa forma, a introdução de um grupo nitrofenilamino aumentou a
atividade citotóxica do composto 2 e manteve o mesmo padrão de morte
celular que o observado pela β-lapachona (PLANCHON et al., 1995; HUANG &
74
PARDEE, 1999; LEE et al., 2006; LIEN et al., 2008; SHAH et al., 2008).
A apoptose também pode ser caracterizada pela condensação e quebra
do DNA, que é detectada em uma fração denominada sub-G1 na citometria
de fluxo, e por mudanças na membrana plasmática, bem caracterizada pela
externalização da fosfatidilserina (RAFFRAY & COHEN, 1997).
A análise da fragmentação do DNA feita por citometria de fluxo,
confirmou as observações morfológicas feitas tanto por May-Grunwald-Giemsa
quanto por LA/BE, mostrando que o grupo nitrofenilamino aumenta a atividade
do composto 2. Como mostrado no ensaio de fragmentação nuclear por
citometria de fluxo, o composto 1 não foi capaz de causar uma fragmentação
significativa do DNA nas concentrações testadas. No entanto, com as mesmas
concentrações do protótipo, o composto 2 causou mais de 80% de
fragmentação do DNA na maior concentração testada (Figura 19). Efeito este
semelhante ao observado nas células tratadas com a doxorrubicina (controle
positivo), droga bastante empregada no tratamento clínico de leucemias
(ASCHE, 2005). Dessa forma, uma diminuição no número de células pode ser
interpretado como uma diminuição na proliferação, entretanto a manutenção da
integridade da membrana celular aliado a fragmentação de DNA leva a
conclusão de que o composto 2 induz apoptose nas células HL-60.
Muitas drogas anticâncer atuam interferindo no ciclo celular. Algumas
são fase-específica e outras fase-inespecífica (de ALMEIDA et al., 2005). O
mecanismo envolvido na interação da β-lapachona no ciclo celular não está
completamente esclarecido e parece estar relacionado com o tipo celular, uma
vez que a parada em uma fase específica do ciclo celular depende da célula
testada (PLANCHON et al., 1995; LI et al., 1995; HUANG & PARDEE, 1999; LI
et al., 2003). Em células leucêmicas HL-60 e em algumas linhagens tumorais
de próstata, por exemplo, a β-lapachona causa um aparente bloqueio na fase
G
0
/G
1
(PLANCHON et al., 1995). Já em células de hepatoma (HepA2) o
bloqueio é feito na fase S (LAI, et al., 1998). Apesar da ação da β-lapachona
sobre as fases do ciclo celular, a citotoxicidade de seus derivados (compostos
1 e 2), no tempo e nas concentrações testadas, não está relacionada a uma
75
fase específica do ciclo celular. Apenas o composto 2, na concentração de
2μM, demonstrou uma tendência à diminuição de G2/M. Como a β-lapachona,
seus derivados podem ter ações diferentes em diferentes linhagens, sendo
necessário mais estudos para a elucidação do mecanismo de ação.
Outro parâmetro analisado foi a despolarização da membrana
mitocondrial. A mitocôndria atua em papel central na regulação da sinalização
apoptótica (GREEN, 1998; GOGVADZE & ORRENIUS, 2006). Mudanças no
potencial de membrana mitocondrial são eventos iniciais que ocorre após a
indução da apoptose, principalmente pela via intrínseca ou via mitocondrial
(HAN et al., 2006; ORRENIUS, 2004). Assim, quando proteínas pró-apoptóticas
são liberadas do espaço intramembranar da mitocôndria, através de um poro
formado na membrana externa, haverá também a saída de H+, causando
despolarização mitocondrial (HENGARTNER et al, 2000). A alteração no
potencial transmembrânico mitocôndrial é um modo para verificação indireta da
ativação da via intrínseca (ORRENIUS, 2004). Assim, as células HL-60
tratadas com o composto 2 apresentaram significante despolarização
mitocondrial quando tratadas com 1,0 µM e 2,0 µM, sugerindo que esse
composto induz ativação da via intrínseca da apoptose. Estudos realizados
com a β-lapachona demonstram que a via intrínseca está envolvida na morte
celular por apoptose (LI et al., 1999b), o que corrobora com os dados dos
compostos 2.
Um dos principais processos que ocorrem na apoptose é a perda da
assimetria da membrana fosfolipídica com a translocação da fosfatidilserina da
membrana interna da bicamada lipídica para superfície celular (VERMES et al.,
1995). A fosfatidilserina é um fosfolipídio interno de membrana, que ao ser
externalizado sinaliza para os macrófagos que a célula seja fagocitada,
evitando a liberação do conteúdo celular no meio (ZIMMERMANN et al., 2001).
A indução de apoptose foi mensurada através da externalização da
fosfatidilserina, utilizando uma dupla coloração com 7-AAD e Anexina V
conjugada a ficoeritrina (PE), onde os compostos 1 e 2 induziram a
76
externalização da fosfatidilserina na dose de 2μM, sendo que o derivado
apresentou atividade significantemente maior que seu protótipo.
Os parâmetros analisados por citometria e coloração diferencial
confirmam as alterações morfológicas compatíveis com apoptose de células
tratadas com o composto 2, que também são observadas em células tratadas
com a β-lapachona (GUPTA et al., 2002; LI et al., 2000; LI et al., 1999a; LI et
al., 1999b), mas não com composto 1 nas concentrações de 1,0 e 2,0 μM.
Apesar do aumento de células necróticas observadas na dose de 2μM, esse
evento é, possivelmente, secundário à apoptose, visto que na apoptose,
quando não há a completa fagocitose dos corpos apoptóticos, haverá a
degradação dos seus constituintes intracelulares levando a célula à necrose,
sendo este processo denominado necrose secundária (ZIEGLER &
GROSCURTH, 2004).
É conhecido que as quinonas geram espécies reativas de oxigênio e que
estes podem ativar vias intracelulares que levam à apoptose (RICCI & ZONG,
2006). As espécies reativas de oxigênio (EROs) são constituídas por uma
variedade de moléculas e radicais livres derivados do oxigênio molecular
(TURRENS, 2003). Já o conjunto de processos deletérios resultantes de um
desbalanço entre a formação excessiva de EROs e o sistema de defesa
antioxidante é denominado estresse oxidativo (TURRENS, 2003; ANDREYEV
et al., 2005).
As EROs são conhecidas não somente por atacar o DNA, mas por afetar
componentes celulares tais como proteínas e lipídios (EVANS et al., 2004). As
EROs tem sido consideradas moléculas chave que podem seletivamente
modificar proteínas e portanto regular a sinalização celular, incluindo a
apoptose. Uma variedade de agentes anticâncer induzem apoptose através da
geração de EROs (MIZUTANI et al., 2002; KIM et al., 2005; MIZUTANI et al.,
2005). O mecanismo citotóxico de muitas naftoquinonas, como a juglona, a
plumbagina e a menadiona, tem sido associado à excessiva geração de EROS
tais como radicais superóxido, oxigênio singlet e peróxido de hidrogênio
(INBARAJ & CHIGNELL, 2004; CHUNG et al., 1999; SEUNG et al., 1998). De
77
acordo com os resultados, a citotoxicidade dos compostos testados pode estar
relacionada com a geração de espécies reativas de oxigênio (EROs), visto que
os níveis intracelulares de Eros aumentou nas células tratadas com os
compostos 1 e 2.
Muitas drogas utilizadas na terapia do câncer tais como daunorrubicina,
doxorrubicina, mitoxantrona, bleomicina e cisplatina promovem estresse
oxidativo pela produção de EROs (RUSSO et al., 1984; NOVAK & KHARASCH,
1985; MANSAT-de MAS et al., 1999; MINOTTI et al., 2001; BAEK et al., 2003).
O estresse oxidativo é conhecido por afetar um número de funções celulares
incluindo a integridade de membrana celular (CEJAS et al., 2004) e causar
instabilidade genômica induzindo danos ao DNA (HIGUCHI, 2003).
O tratamento de células leucêmicas HL-60 com ambos compostos
testados levaram a um aumento dos níveis intracelulares de EROs de maneira
concentração-dependente, chegando a níveis máximos de 70,6% e 89% em
células tratadas com os compostos 1 e 2 na concentração de 2,0 µM,
respectivamente na primeira hora de exposição. Vários trabalhos
demonstraram que a β-lapachona promove elevação dos níveis de H
2
O
2
e O
2
•–
em células deficientes em NAD(P)H: quinona oxirredutase (NQO1), como
células de leucemia HL-60. Esse aumento nos níveis de EROs induz a
apoptose em estágios posteriores (SHIAH et al., 1999; PINK, et al., 2000),
indicando que o mecanismo de indução de apoptose observado pelo
tratamento do composto 2 pode estar parcialmente relacionado a geração de
EROs em HL-60, visto que também há uma indução de EROS pelo composto 1
sem no entanto levar a célula à apoptose. Portanto, novos estudos devem ser
realizados para elucidação do mecanismo de ação dos compostos testados e o
envolvimento das EROS na indução da apoptose.
78
Conclusão
79
6. CONCLUSÃO
Os resultados sugerem que a introdução do radical nitrofenilamino na
posição 3 do anel furano aumenta a citotoxicidade do composto 2 em células
HL-60 quando comparado ao seu protótipo nor-β-lapachona (composto 1). O
composto 2 induz morte celular por apoptose, além de aumentar os níveis de
espécies reativas de oxigênio. Esses achados apontam para o potencial
dessas quinonas sintéticas como protótipo para a produção de novos
compostos com propriedades anticâncer.
80
Referências
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2
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105
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L., CAPPELLINI A, CUTRONEO G, VITALE M, PAPA S. Supravital Exposure to
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ZUCO, V., SUPINO, R., RIGHETTI, S.C., CLERIS, L., MARCHESI, E.,
PASSERINE- GAMBACORTI, C., FORMELLI, F. Selective cytotoxicity of
betulinic acid on tumor cell lines, but not on normal cells. Cancer Letters 175:
17-25, 2002.
106
ANEXO I
Equipamentos
Agitador de placa Shaker PSU – 2T plus
Agitador de placa, MLW Modelo Thys 2
Agitador de tubo, Donner AD 8850
Banho-maria, DELLTA Modelo 105Di
Centrífuga Centimicro FANEN Modelo 212
Centrífuga de lâminas, Serocito®, Centrifuge Mod. 2400, FANEM®
Centrífuga de placas, Eppendorf Modelo Centrifuge 5403
Centrífuga Excelsa Baby I FANEN Modelo 206
Citômetro de fluxo Guava EasyCyte Mine
Espectrofotômetro de placa, DTX 880 Multimode Detector, Beckman Coulter, Inc.
Fullerton, California, USA
Estufa de secagem e esterilização FANEM Modelo 315 SE
Fluxo laminar VECO
High Throughput Screening (HTS)/Laboratory Automation Workstation, Biomek
3000, Beckman Coulter
Incubadora de células (CO2 Water-Jacket Incubator) NUAIRE TS Autoflow
Máquina fotográfica digital, Olympus C-7070
Microondas, Panasonic
Microscópio de fluorescência, Olympus Modelo BX41
Microscópio óptico de inversão, Nikon Diaphot
Microscópio óptico OPTON TNB-04T-PL/PZO-Labimex Modelo Studar lab
pHmetro, Micronal B474
Pipetas automáticas, Gilson
107
3.1.2. Soluções e Reagentes
NOMES
CONCENTRAÇÕES MARCA
Alamar Blue 0,312 mg/mL Sigma
Álcool Etílico 70% Vetec
0,2 g
Eosina-Azul de Metileno
(May- Grunwald)
Metanol q.s.p. 100 mL de solução
Reagen
Giemsa - Bioclin
1mg de iodeto de propídeo Boehringer
Iodeto de propídeo 1mg/mL
PBS q.s.p. -
Meio de cultura de células
RPMI 1640
Diluído em água deionizada e
esterelizada, filtrado em filtro
millipore – 0,22 mm – e
complementado com 10% SBF, 1%
de glutamina, 1% de antibióticos,
1% de bicarbonato de sódio (0,75%)
e 25 mM de HEPES
Cultilab
20 mg de MTT Sigma
MTT
PBS q.s.p. 100 mL de solução -
Penicilina 10.000 U.I./mL Cultilab
Penicilina - estreptomicina
Estreptomicina 10 mg/mL Cultilab
8,5 g de Cloreto de sódio (0,85%) Labsynth
Solução salina (para
hemólise)
1,11 g de Cloreto de cálcio (10 mM) Reagen
108
H
2
O q.s.p 1 L de solução -
Soro fetal bovino - Cultilab
8,766 g de Cloreto de sódio Labsynth
2,14 g de NaHPO4.7H
2
O Labsynth
0,276 g de NaHPO4.H
2
0
Labsynth
Tampão fosfato (PBS)
H
2
0 q.s.p. 1 L de solução(pH = 7,2) -
DMSO
Vetec
1 µL de anticorpo anti-BrdU Sigma®
Anticorpo anti-BrdU
BSA 5 % q.s.p. 500 µL de solução Dako
Anticorpo biotinilidado anti-
imunoglobulina de
camundongo
1 µL de anticorpo anti-
imunoglobulina
BSA 5 % q.s.p. 100 µL de solução
Sigma®
BrdU 10mM - Sigma®
1mg de brometo de etídeo Sigma®
Brometo de Etídio 100
μg/mL
PBS q.s.p 10 mL de solução -
Citrato de Sódio - Grupo Química
Cloreto de Sódio (NaCl) - Labsynth®
EDTA - Qeel
1 µL de Estreptavidina – peroxidase Sigma®
Estreptavidina – peroxidase
BSA 5 % q.s.p. 100 µL de solução Dako®
5 µL de DAB
Immunotech©
1 mL de Tris-HCl (Tris 0,05M) pH=
7,6
Proquímios
Diaminobenzidina (DAB)
2 µL de H
2
O
2
Proquímios
109
Cloreto de sódio 1,5 M -
Citrato de sódio 0,15 M
SSC 10X
H
2
O
8,766 g de Cloreto de sódio Labsynth®
2,14 g de NaHPO4.7H
2
O Labsynth®
0,276 g de NaHPO4.H
2
0 Labsynth®
Tampão fosfato (PBS)
H
2
0 q.s.p. 1 L de solução (pH = 7,2) -
Cloreto de sódio 1,5 M Labsynth®
Tris 0,5 M (pH= 7,6) Proquímios®
Tampão Tris (TBS) 10X
H
2
O -
50 mL de Tripsina 2,5 % Cultilab®
0,125 g de EDTA Proquímios®
Tripsina 0,25%
450 mL de PBS -
Triton X -100 - Isofar
Fármaco
Doxorrubicina Zodiac (fornecida pela farmácia do Instituto do Câncer do Ceará
– ICC).
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