( PDF ) Depressão pós estimulatória dos barorreceptores aórticos em ratos e camundongos: influência dos derivados da ciclooxigenase e de espécies reativas de oxigênio

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UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO

FACULDADE DE MEDICINA DE RIBEIRÃO PRETO

VALTER JOVINIANO DE SANTANA FILHO

Depressão Pós-Estimulatória dos Barorreceptores Aórticos em

Ratos e Camundongos: Influência dos Derivados da Ciclooxigenase

e de Espécies Reativas de Oxigênio

Ribeirão Preto

2009

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VALTER JOVINIANO DE SANTANA FILHO

Depressão Pós-Estimulatória dos Barorreceptores Aórticos em

Ratos e Camundongos: Influência dos Derivados da Ciclooxigenase

e de Espécies Reativas de Oxigênio

Tese apresentada ao Programa de Pós-

Graduação do Departamento de Fisiologia da

Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da

Universidade de São Paulo, para obtenção do

título de doutor em Ciências, área de

concentração: Fisiologia

Orientador: Prof. Dr. Rubens Fazan Jr.

Ribeirão Preto

2009

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AUTORIZO A REPRODUÇÃO E DIVULDAÇÃO TOTAL OU PARCIAL DESTE

TRABALHO, POR QUALQUER MEIO CONVENCIONAL OU ELETRÔNICO,

PARA FINS DE ESTUDO E PESQUISA, DESDE QUE CITADA A FONTE.

FICHA CATALOGRÁFICA

Santana-Filho, Valter Joviniano

Depressão Pós-Estimulatória dos Barorreceptores Aórticos em Ratos

e Camundongos

Ribeirão Preto, 2009. 127p

Tese de doutorado apresentada à Faculdade de Medicina de Ribeirão

Preto/USP. Área de concentração: Fisiologia

Orientador: Fazan Jr, Rubens

1. Rato. 2. Barorreceptor. 3. Estimulação Elétrica. 4. Coarctação de

Aorta. 5. Hipertensão

Folha de Aprovação

Valter Joviniano de Santana Filho

Depressão Pós-Estimulatória dos Barorreceptores Aórticos em Ratos

e Camundongos

Tese apresentada ao Programa de Pós-

Graduação do Departamento de Fisiologia da

Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto da

Universidade de São Paulo, para obtenção do

título de doutor em Ciências, área de

concentração: Fisiologia

Aprovado em:____/_____/_____

Banca Examinadora

Prof. Dr.____________________________________________________

Instituição:_________________ Assinatura:_______________________

Prof. Dr.____________________________________________________

Instituição:_________________ Assinatura:_______________________

Prof. Dr.____________________________________________________

Instituição:_________________ Assinatura:_______________________

Prof. Dr.____________________________________________________

Instituição:_________________ Assinatura:_______________________

Prof. Dr.____________________________________________________

Instituição:_________________ Assinatura:_______________________

Aos meus pais, Valter e Maria José, pelo amor incondicional, carinho,

crédito, sabedoria, incentivo e compreensão, em tudo, amo vocês

Ao meu amor, esposa-companheira, confidente, conselheira, amiga,

pelo amor, respeito, apoio, paciência, por tudo, Josi, amo você!

AGRADECIMENTOS

“Há pessoas que passam pela nossa vida e deixam um pouco de si.

Há pessoas que passam e levam um pouco de nós.

Há também aquelas que não passam, simplesmente ficam.”

Autor Desconhecido

A Deus, Pai fiel, comigo em todas as horas: da súplica, do

agradecimento e da entrega;

A meu orientador, Prof. Dr. Rubens Fazan Jr, pela disponibilidade

desde o início de minha jornada acadêmica em Ribeirão Preto,

credibilidade, orientações, conselhos, profissionalismo e amizade

que cresceu ainda mais durante esses anos de convívio;

A meus irmãos Regina, Tânia, Eurídice, Ana Paula e Adilson e

sobrinhos, amo vocês;

À minha grande família, tios maravilhosos e divertidos, primos que

são verdadeiros irmãos para mim, agradecendo especialmente a

tia Socorro e tio Helio, que num ato de carinho e estímulo

cuidaram com uma atenção ímpar de minha mãe durante minha

ausência;

Aos meus ex-orientadores da graduação, que hoje tenho orgulho

de tê-los como grandes amigos, cronologicamente, Prof. Dr.

Francisco Prado Reis, Prof. MSci. José Aderval Aragão, Prof. MSci.

Walderi Monteiro da Silva Junior e Prof. Esp. Ronaldo Queiroz

Gurgel, por sempre me incentivar, cobrar por melhores resultados

buscando sempre o melhor para mim;

Ao Prof. Dr. Helio Cesar Salgado, do Departamento de Fisiologia,

pelos ensinamentos e amizade que me proporcionou durante esses

anos;

Ao Prof. Dr. José Antunes Rodrigues que, com sua extrema

sabedoria e humildade, me mostrou o caminho que devo seguir e,

principalmente, como agir;

À secretaria da Fisiologia, Elisa, Claudia, Carlos e Fernandinho,

pela competência na execução de seus serviços, sempre com o

mesmo sorriso e delicadeza, amizade e companheirismo, vocês

são verdadeiros anjos e estarão sempre no meu coração;

À Coordenação do Departamento de Fisiologia, na pessoa do Prof.

Dr. Benedito Machado;

A Carlos Alberto Aguiar, Mauro de Oliveira e Jaci Castanhia,

técnicos do Laboratório de Fisiologia Cardiovascular, pelo apoio

técnico no decorrer da pesquisa;

A Betão, Maurão e Jaci pela amizade, ensinamento,

companheirismo, atenção e amizade, não há palavra no mundo

que reflita a gratidão que tenho por vocês;

Aos meus grandes amigos que, de uma forma ou de outra, estão

sempre comigo, aqueles que deixei no Nordeste, os grandes

amigos de Ribeirão Preto e de Iowa City. Obrigado por tudo!!!

Em especial, gostaria de agradecer ao Marcio (baiano) por ter me

acolhido em sua casa, se tornando mais que um amigo, um

conselheiro. Obrigado.

Aquelas pessoas que por esquecimento não citei, mas sabem que

estão no meu coração.

O meu MUITO OBRIGADO a todos vocês!!!

“Leva tempo para alguém ser bem

sucedido porque o êxito não é mais

do que a recompensa natural pelo

tempo gasto em fazer algo direito”

(Joseph Ross)

Lista de Figuras

Figura 1: Fotomicrografia eletrônica de um segmento proximal (próximo

do nervo laríngeo superior) de um nervo depressor aortico de um rato da

linhagem Wistar. ....................................................................... - 21 -

Figura 2: Histograma de distribuição de tamanho das fibras amielínicas e

mielínicas do nervo depressor aórtico de ratos normotensos da linhagem

Wistar. .................................................................................... - 21 -

Figura 3: Registro simultâneo da pressão arterial (PA) pulsátil e atividade

do nervo depressor aórtico (NDA) de rato. .................................... - 22 -

Figura 4: Representação esquemática da relação entre PA e atividade dos

barorreceptores. ....................................................................... - 25 -

Figura 5: Representação esquemática da PA (painel superior) e atividade

dos barorreceptores (painel inferior) mostrando o fenômeno de adaptação

e DPE. ..................................................................................... - 27 -

Figura 6: Representação esquemática da preparação utilizada para realizar

a Estimulação Antidrômica do NDA. ............................................. - 40 -

Figura 7: Registro representativo da pressão arterial pulsátil (painel

superior), e atividade integrada do NDA (painel inferior), durante

hipertensão mantida (10 minutos) pela coarctação da aorta.. .......... - 49 -

Figura 8: Valores (Média±EPM) da PAM e atividade integrada do NDA em

ratos submetidos a hipertensão mantida (10 minutos) através da

coarctação da aorta abdominal. ................................................... - 50 -

Figura 9: Registro simultâneo da pressão arterial média, painel superior, e

atividade integrada do NDA, painel inferior, durante hipertensão mantida

(3 minutos) pela coarctação da aorta. .......................................... - 51 -

Figura 10: Valores (Média±EPM) da PAM e da atividade integrada do NDA

em ratos submetidos a hipertensão mantida por 10 e 3 minutos através

da coarctação da aorta abdominal ............................................... - 52 -

Figura 11: Valores (Média±EPM) da PAM e atividade integrada do NDA em

ratos submetidos a hipertensão mantida (3 minutos) através da

coarctação da aorta abdominal. ................................................... - 53 -

Figura 12: Valores (Média±EPM) da PAM e atividade integrada do NDA em

ratos submetidos a hipertensão mantida (3 minutos) através da

coarctação da aorta abdominal antes e após PEG-catalase. ............. - 55 -

Figura 13: Valores (Média±EPM) da PAM e atividade integrada do NDA em

ratos submetidos a hipertensão mantida (3 minutos) através da

coarctação da aorta abdominal antes e após indometacina. ............. - 56 -

Figura 14: Valores (Média±EPM) da PAM e atividade integrada do NDA em

ratos submetidos a hipertensão mantida (3 minutos) pela coarctação da

aorta abdominal antes e após PEG catalase + indometacina. ........... - 58 -

Figura 15: Registro simultâneo da pressão arterial e atividade do NDA

antes (basal) e após estimulação antidrômica do NDA (seta). .......... - 59 -

Figura 16: Pressão arterial e atividade Integrada do nervo depressor

aórtico de um rato, antes (basal) e após a estimulação elétrica

antidrômica do NDA. .................................................................. - 60 -

Figura 17: Valores (Média±EPM) da PAM e atividade integrada do NDA dos

ratos submetidos a estimulação antidrômica do NDA. ..................... - 61 -

Figura 18: Valores (Média±EPM) da PAM e atividade integrada do NDA em

ratos submetidos a estimulação elétrica antidrômica do NDA antes e após

salina. ..................................................................................... - 62 -

Figura 19: Valores (Média±EPM) da PAM e atividade integrada do NDA em

ratos submetidos a estimulação antidrômica do NDA antes e após PEG-

catalase. .................................................................................. - 64 -

Figura 20: Valores (Média±EPM) da PAM e atividade integrada do NDA em

ratos submetidos a estimulação antidrômica do NDA antes e após

indometacina. ........................................................................... - 65 -

Figura 21: Valores (Média±EPM) da PAM e atividade integrada do NDA em

ratos submetidos a estimulação antidrômica do NDA antes e após

associação da PEG-catalase e indometacina. ................................. - 67 -

Figura 22: Valores (Média±EPM) da atividade integrada do NDA em

camundongos estimulados com várias freqüências. ........................ - 68 -

Figura 23: Valores (Média±EPM) da PAM e atividade integrada do NDA em

camundongos. .......................................................................... - 69 -

Figura 24: Valores (Média±EPM) da PAM e atividade integrada do NDA em

ratos submetidos a estimulação antidrômica do NDA antes e após PEG-

catalase. .................................................................................. - 70 -

Índice

1. INTRODUÇÃO ...................................................................... - 15 -

2. OBJETIVOS .......................................................................... - 33 -

3. MATERIAL E MÉTODOS ........................................................ - 35 -

Animais ................................................................................. - 36 -

Drogas Utilizadas .................................................................. - 37 -

Experimentos em Ratos ........................................................ - 37 -

Instrumentação e Registros ................................................. - 37 -

Coarctação da Aorta ............................................................. - 39 -

Estimulação Antidrômica do NDA. ......................................... - 39 -

Protocolos Experimentais ................................................ - 40 -

Experimentos em Camundongos ........................................... - 42 -

Instrumentação e Registros ................................................. - 42 -

Protocolos Experimentais ................................................ - 44 -

3.6. Processamento dos registros ......................................... - 45 -

Estatística ............................................................................. - 46 -

4. RESULTADOS ....................................................................... - 47 -

Estimulação dos Barorreceptores pela Coarctação da Aorta

Abdominal ............................................................................ - 48 -

Estimulação Antidrômica do Nervo Depressor Aórtico .......... - 58 -

Estimulação Elétrica Antidrômica do NDA em Camundongos - 67 -

5. DISCUSSÃO ......................................................................... - 71 -

6.Resumo ................................................................................ - 83 -

7.Abstract ................................................................................ - 85 -

8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .......................................... - 87 -

10. MANUSCRITO ................................................................... - 106 -

1. INTRODUÇÃO

- 16 -

O sistema nervoso central, bem como uma variedade de

reflexos, controla a atividade eferente autonômica para o coração, os

vasos sangüíneos, os rins e outros órgãos importantes na

determinação da homeostase circulatória. A pressão arterial (PA)

deve ser continuamente mantida dentro de estreitos limites de

variabilidade, a fim de que todos os órgãos e tecidos sejam

idealmente perfundidos. Essa manutenção é feita por meio de vários

mecanismos que, de certa forma, são interrelacionados. Dentre estes,

a regulação neural (autônoma) da circulação desempenha um papel

fundamental, especialmente para os ajustes rápidos da PA [Salgado e

cols 2004].

Alterações na regulação neural da circulação têm importantes

implicações em estados fisiológicos e patológicos, como:

envelhecimento, hipertensão arterial, insuficiência cardíaca, diabete

melito, obesidade. Fatores como aumento da atividade eferente

simpática, redução na sensibilidade do barorreflexo e menor

variabilidade da frequência cardíaca (FC) estão fortemente associados

ao aumento do risco de arritmias ventriculares e morte súbita [Podrid

e cols 1990, Kaye e Esler 1995]. O comprometimento da regulação

neural da circulação também leva a um aumento da variabilidade da

PA, causando lesões em órgãos-alvo e aumento do risco

cardiovascular [Mancia e cols 1994].

O mecanismo neural de controle da PA mais estudado e,

- 17 -

provavelmente, o mais importante, é o barorreflexo arterial. O

barorreflexo arterial é o principal responsável pela regulação

momento a momento da PA [Krieger e cols 1982], exercendo

importante papel na regulação da FC, do débito cardíaco, da

contratilidade miocárdica, da vasomotricidade e da distribuição

regional do fluxo sangüíneo.

A função primordial do barorreflexo é controlar a PA batimento

a batimento, em diferentes situações comportamentais (exercício

físico, mudança de postura, sono, entre outras), mantendo-a em uma

faixa de variação extremamente estreita [Krieger e cols 1982].

O barorreflexo inicia-se a partir da ativação dos barorreceptores

arteriais, que são terminações nervosas sensoriais, densamente

ramificadas, agrupadas na crossa da aorta (barorreceptores aórticos)

e nos seios carotídeos (barorreceptores carotídeos) [Krieger e

Marseillan 1963, Bock e cols 1976]. Os barorreceptores arteriais são

mecanorreceptores, portanto, sensíveis à deformação das paredes

dos vasos onde se localizam, cujo grau de ativação é constantemente

transmitido para o sistema nervoso central.

As terminações dos barorreceptores aórticos e carotídeos se

distribuem na camada adventícia da parede vascular, entre feixes de

fibras colágenas, próximas da camada muscular, sem, no entanto,

penetrar na mesma, sendo constituída de fibras nervosas aferentes

mielínicas - de condução rápida - e amielínicas - de condução lenta.

- 18 -

As aferências barorreceptoras carotídeas dão origem ao nervo

do seio carotídeo ou nervo de Hering, que se une ao nervo

glossofaríngeo para atingir o sistema nervoso central. As fibras

originadas nos barorreceptores aórticos formam o nervo depressor

aórtico (NDA), também conhecido como nervo de Cyon, que se

incorpora ao vago. O trajeto anatômico do NDA, até sua união com o

vago, varia bastante entre as espécies animais. Entretanto, via de

regra, ele caminha como um fascículo nervoso isolado, que carrega

quase que exclusivamente fibras barorreceptoras, por um longo

percurso na região cervical. Assim, esse nervo se apresenta como um

importante instrumento para estudos, morfológicos e funcionais, dos

barorreceptores arteriais [Zhang e Mifflin 2000].

O NDA foi descrito em 1866 pelos pesquisadores alemães Cyon

e Ludwig. A sua denominação de depressor se deve porque, após sua

estimulação elétrica, era observada queda da PA e redução da FC.

Desde então, definiu-se que o NDA é, primariamente, um conjunto de

fibras aferentes que transmitem, ao SNC, informações decorrentes

das mudanças na PA do território aórtico. Descrições detalhadas da

origem, curso na região cervical, terminação e tipos de fibras dos

NDA de coelhos, foram realizadas no início do século XX [Sarkar

1922].

O interesse sobre o NDA de ratos aumentou significativamente

a partir dos anos 50, quando essa espécie animal passou a ser

- 19 -

amplamente utilizada nas investigações das funções cardiovasculares.

Experimentos com registros da atividade elétrica do NDAs vinham

sendo realizados sem informações substanciais sobre a origem, o

trajeto e as terminações desse nervo no rato. Em 1958, McCubbin e

colaboradores descreveram o trajeto cervical do NDA em ratos

normotensos da linhagem Sprague-Dawley. Esses pesquisadores

verificaram que seu trajeto cervical é muito variável e esses nervos

estavam presentes, no lado esquerdo, como um fascículo isolado, em

apenas metade dos animais. No lado direito, a freqüência de

aparecimento do NDA isolado é ainda menor. Esses mesmos

pesquisadores observaram que, quando o NDA não era identificado

como um fascículo isolado, a atividade barorreceptora podia ser

registrada no vago ou no nervo laríngeo recorrente.

A anatomia macroscópica do NDA é relativamente bem

conhecida em várias espécies animais, tais como coelhos [McCubbin e

cols 1958], gatos [Agostini e cols 1957] e ratos [Krieger e Marseilan

1963]. Em 1964, Devanandan descreveu o NDA de gatos, sendo o

primeiro autor a contar, medir e distribuir as fibras mielínicas do NDA

em histogramas de tamanho de fibras, demonstrando que os NDAs

de gatos apresentam fibras mielínicas finas (menores que 7 µm de

diâmetro).

As características eletrofisiológicas das descargas dos potenciais

de ação das fibras mielínicas e amielínicas dos NDAs de ratos têm

- 20 -

sido estudadas desde os anos 70 [Brown e cols 1976 e 1978, Thóren

e cols 1977]. Tais estudos evidenciam que tanto as fibras mielínicas

quanto as amielínicas dos NDAs de ratos são barorreceptoras.

Embora muitas das características fisiológicas das fibras

mielínicas e amielínicas dos NDAs de ratos já fossem conhecidas,

apenas ao final dos anos 90, um estudo histológico detalhado,

incluindo informações sobre dimensões e números de fibras

mielínicas e amielínicas, do NDA de ratos normotensos foi realizado

[Fazan e cols 1997].

Fazan e colaboradores [1997] descreveram que o NDA de ratos

normotensos é monofasciculado, sendo o diâmetro desse fascículo

constante (~40 µm), desde sua origem (próxima da aorta) até sua

terminação (no nervo laríngeo superior), delimitado por um perineuro

formado por 2 a 3 camadas de células (Figura 1). O NDA apresenta,

em média, 440 axônios, sendo 20% mielinizados e 80% amielínicos.

O histograma de distribuição de tamanho das fibras mielínicas é

unimodal e mostra que, aproximadamente, 97% destas fibras

apresentam diâmetros menores que 4 µm, e apenas 16%

apresentam diâmetros maiores que 3 µm. O histograma de

distribuição de tamanho das fibras amielínicas é também unimodal e

o diâmetro médio das mesmas é de, aproximadamente, 0,5 µm

(Figura 2).

- 21 -

Figura 1: Fotomicrografia eletrônica de um segmento proximal

(próximo ao nervo laríngeo superior) de um nervo depressor aortico

de um rato da linhagem Wistar. Adaptado de Fazan e cols 1997.

Figura 2: Histograma de distribuição de tamanho das fibras

amielínicas e mielínicas do nervo depressor aórtico de ratos

normotensos da linhagem Wistar. Adaptado de Fazan e cols 1997.

- 22 -

Tem sido descrito que o principal, e provavelmente único,

mecanismo de ativação dos barorreceptores arteriais é a sua

deformação mecânica, proveniente do grau de distensão da parede

vascular [Salgado e Krieger 1978]. Na PA normal, a despolarização

dos terminais barorreceptores é intermitente e sincrônica com a fase

sistólica dos pulsos de pressão (figura 3).

Figura 3: Registro simultâneo da pressão arterial (PA) pulsátil e

atividade do nervo depressor aórtico (NDA) de rato.

Quando a PA se eleva, ocorre uma maior deformação mecânica

das terminações nervosas decorrente da distensão do vaso, levando a

- 23 -

um aumento do número de potenciais gerados nos barorreceptores

até atingir a frequência máxima de despolarizações (saturação).

Quando ocorrem quedas na PA, a atividade nos barorreceptores

diminui até cessar completamente (Figura 3). A relação entre a PA e

a atividade dos barorreceptores tem um formato sigmoidal, do limiar

de descarga até a atividade máxima dos barorreceptores, cujo ponto

médio situa-se próximo à PA média normal (Figura 4). A ativação dos

barorreceptores provoca inibição das descargas simpáticas para vasos

e coração, e aumento de atividade parassimpática cardíaca, o que

produz uma redução da resistência periférica total e, também, do

débito cardíaco, contribuindo assim para a volta da PA aos níveis

normais [Abboud e cols. 1976, Kirchheim 1976, Krieger e cols. 1982].

A sensibilidade dos barorreceptores à deformação da parede

vascular pode ser modulada por mecanismos físicos, neurais e

humorais [Li e Chapleau 1995]. O tono da musculatura lisa vascular

tem sido sugerido como um dos principais mecanismos moduladores

da atividade dos barorreceptores [Kunze e cols 1986, Salgado e

Krieger 1988]. De maneira geral, substâncias vasoconstrictoras,

como angiotensina II e noradrenalina, atuam diminuindo a atividade

dos barorreceptores arteriais, devido à sua ação de encurtamento das

fibras musculares lisas, aumentando assim, o limiar pressórico de

despolarização dos barorreceptores [Shen e cols. 1991, Wang e cols.

1992]. A vasopressina, ao contrário, parece aumentar a sensibilidade

- 24 -

dos barorreceptores, provavelmente por meio de uma ação no

componente central desse reflexo [O'Donnell 1992].

As células endoteliais produzem e liberam vários fatores que

podem atuar de maneira parácrina, modulando a atividade dos

barorreceptores [Chapleau 1991a, Salgado e cols 2006]. Os

metabólitos do ácido araquidônico (prostanóides) aumentam a

sensibilidade dos barorreceptores arteriais à distensão da parede dos

vasos [Chen e cols 1990, Chapleau e cols 1991b]. O endotélio

também pode liberar fatores que suprimem a atividade dos

barorreceptores [Chapleau e cols 1988a].

É amplamente conhecido que a exposição mantida dos

barorreceptores a um nível elevado de PA determina a adaptação

destes ao novo nível pressórico. Se a exposição for de curta duração

(minutos ou horas), ocorre o que chamamos de adaptação aguda, ou

seja, a faixa de funcionamento dos barorreceptores se desloca,

parcial ou totalmente, em direção aos níveis de hipertensão. Se a

exposição for prolongada (dias ou semanas), ocorre adaptação

crônica dos barorreceptores, o que, além de deslocar sua faixa de

atividade para níveis de hipertensão, reduz a atividade máxima dos

mesmos [Chapleau e cols 1988b, Salgado e Machado 1991, Salgado e

cols 2004] (Figura 4). As alterações visco-elásticas que a parede

vascular sofre com as alterações mantidas da PA, reduzindo o grau

de deformação das terminações neurais, têm sido apontadas como a

- 25 -

principal causa da adaptação dos barorreceptores [Chapleau e cols

1988b]. Entretanto, mecanismos intrínsecos (moleculares) do próprio

terminal barorreceptor (por exemplo, a ativação da Na

+

/K

+

ATPase no

terminal do nervo baroreceptor), assim como substâncias liberadas,

por exemplo, pelo endotélio vascular, parecem exercer um

importante papel no fenômeno de adaptação dos barorreceptores

arteriais.

Figura 4: Representação esquemática da relação entre PA e

atividade dos barorreceptores. Adaptado de Chapleau e cols 1988.

Um outro fenômeno descrito em receptores sensoriais [Blair e

Evans 1991], bem como nos barorreceptores arteriais, é a chamada

depressão pós-estimulação (DPE). Após um período, mesmo que

- 26 -

muito breve (3 minutos), de hipertensão arterial, quando a PA

retorna subitamente aos seus valores normais, a atividade dos

barorreceptores cai a valores bem inferiores àqueles observados

antes da elevação, caracterizando assim a DPE [Bronk e Stella 1935,

Landgren 1952, Franz 1969] (Figura 5). Inicialmente esse fenômeno

havia sido relacionado com a estimulação mecânica do receptor, pois

com a redução do estímulo hipertensor (que ativa os

barorreceptores) ocorreria uma alteração nas propriedades

viscoelásticas da parede do vaso reduzindo a atividade dos

barorreceptores e causando a DPE [Franz 1969]. Outros estudos

relacionaram esse fenômeno como sendo decorrente de alterações na

permeabilidade iônica das células do próprio terminal barorreceptor,

ocorrida quando o mesmo é ativado [Nakajima 1966, Nakajima

1969a, Nakajima 1969b].

- 27 -

Figura 5: Representação esquemática da PA (painel superior) e

atividade dos barorreceptores (painel inferior) mostrando o fenômeno

de adaptação e DPE. Adaptado de Chapleau e Abboud 1994.

Estudo de Sokolove e Cooke [1971] mostrou que a estimulação

elétrica de neurônios mecanorreceptores isolados levava à adaptação

da frequência de descarga dos mesmos, bem como uma

hiperpolarização do potencial de repouso desses mecanorreceptores

após o final do estímulo elétrico. Contudo, quando se utilizava

glicosídios cardíacos, ou meio que sem potássio (procedimentos que

bloqueiam a bomba de Na

+

/K

+

), havia um bloqueio desta

hiperpolarização pós estimulatória, sugerindo o envolvimento da

bomba de Na

+

/K

+

nesse fenômeno.

Apesar da existência desse e outros estudos para elucidar o

mecanismo da gênese da DPE [Nakagima e Takahashi 1966, Davis e

- 28 -

cols 1998], pouco se sabe no que concerne à identificação e função

de fatores químicos essenciais para gênese desse fenômeno e que

podem influenciar as terminações sensoriais aferentes do reflexo

barorreceptor. Além disso, todos esses estudos foram realizados em

preparações isoladas, e nunca in vivo.

Várias substâncias foram descritas como potenciais

moduladores da atividade dos barorreceptores. Fatores que diminuem

a sensibilidade dos barorreceptores como, por exemplo, o óxido

nítrico (NO) exógeno [Salgado e cols 2006] e as espécies reativas de

oxigênio (ROS) [Bechir e cols 2005], bem como os fatores que

aumentam a sensibilidade dos mesmos, tais como o metabólito da

ciclooxigenase, prostaciclina (PGI

2

) [Chapleau e cols. 1995, Wang e

cols. 2004]. Entretanto, a influência dessas substâncias na gênese

e/ou modulação da DPE nunca foi avaliada.

O estresse oxidativo é caracterizado por uma produção

excessiva de ROS, que supera a capacidade dos mecanismos

antioxidantes. O estresse oxidativo tem sido associado a diversos

processos fisiopatológicos que afetam o sistema cardiovascular, como

a hipertensão arterial, hipercolesterolemia, diabetes dentre outros

[Steinberg e Witztum 2002, Chisolm e Steinberg 2000, Cai e Harrison

2000, Feletou e Vanhoutte 2006]. No âmbito experimental, o estresse

oxidativo tem sido observado em ratos espontaneamente hipertensos

[Wu e Juurlink 2002], hipertensão renovascular [Lerman e cols

- 29 -

2001], e no modelo de hipertensão induzida pela obesidade em ratos

[Dobrian e cols 2001]. Entretanto, não está claro se esse aumento

nos níveis de ROS é causa ou consequência do processo de evolução

dessas doenças [Ward e Croft 2006, Chen e cols 2001]. Potenciais

fontes de radicais livres que poderiam estar envolvidos na redução da

atividade dos barorreceptores incluem a mitocôndria, via das enzimas

NADPH oxidase, xantina oxidase, óxido nitrico sintase endotelial livre

e enzimas do citocromo peroxidase [Fleming e cols 2001, Sarkis e

Roman 2004]. Além disso, enzimas como as lipoxigenases e a

ciclooxigenase também podem gerar ROS. Contudo, estudos

mostrando a participação dessas enzimas no processo de formação

de ROS são escassos [Droge 2002]. A ativação do sistema renina-

angiotensina, comumente encontrada na hipertensão, tem sido

proposta como mediadora da ativação da enzima NADPH oxidase

aumentando a produção de ROS [Zalba e cols 2001]. Angiotensina II

pode também regular a ativação da enzima NADPH oxidase

diretamente pela fosforilação e translocação da sua subunidade

citoplasmática p47phox para membrana celular [Touyz e cols 2003].

Além disso, o estresse mecânico promovido pelo aumento da

velocidade da passagem do sangue no vaso sanguíneo pode

promover a translocação da p47phox para a membrana e ativar a

enzima NADPH oxidase em células musculares lisas vasculares [Grote

e cols 2003]. Estudos em neurônios baroreceptores, isolados (em

- 30 -

cultura), sugerem que as ROS podem também ser formadas nas

terminações nervosas dos baroreceptores [Snitsarev e cols 2005].

Assim, é plausível sugerir uma possível participação da ROS na DPE

dos barorreceptores.

Outra substância extremamente importante no controle da

função barorreceptora é a prostaciclina (PGI

2

). Essa substância é

produzida nas células endoteliais vasculares em resposta a estímulos

fisiológicos e/ou patológicos que ativam reações enzimáticas

sequenciais que incluem a liberação do ácido aracdônico dos

fosfolipídeos, o qual é posteriormente convertido em prostaglandina

H

2

, quando, então, a enzima prostaciclina sintase o converte em PGI

2

[Smith e cols 1991]. A função primordial da PGI

2

tem sido descrita

como fator de inibição da agregação plaquetária, bem como

controlador da contração da musculatura lisa [Moncada e Vane

1978]. Porém, outros estudos mostram que a PGI

2

ativa neurônios

sensoriais, dentre eles os neurônios barorreceptores, por meio, da

alteração da condução iônica [Chapleau e cols 1991b]. Nesse estudo,

os pesquisadores administraram PGI

2

numa preparação do seio

carotídeo isolado e observaram um aumento na sensibilidade dos

baroreceptores sem alteração da relação de distensibiliade da parede

vascular, demonstrando uma ação dessa substância diretamente

sobre os terminais barorreceptores. Contudo, não há registro na

literatura de trabalhos demonstrando a ação das PGI

2

na geração ou

- 31 -

modulação da DPE.

A estimulação antidrômica de nervos sensoriais, técnica

descrita primeiramente por Holton [1958], pode ser observada em

uma variedade de condições experimentais [Decima 1969], sendo

vastamente utilizada até os dias atuais [Guo e cols 2008]. Davis e

colaboradores [1998] demonstraram que, sem qualquer alteração da

PA, a estimulação elétrica antidrômica do NDA é sucedida por uma

inibição de sua atividade elétrica espontânea (depressão pós-

estimulação) que pode durar de segundos a minutos e parece

depender do tipo de fibra estimulada (tipo A ou C). Desse modo, um

aumento sustentado na atividade dos baroreceptores conseguido

através da estimulação, que mimetizaria o aumento da atividade dos

barorreceptores durante a hipertensão, poderia fazer com que fatores

humorais fossem liberados ao nível das terminações nervosas dos

mesmos, modulando sua adaptação, sendo uma ferramenta bastante

útil no estudo da adaptação dos barorreceptores.

As últimas décadas foram marcadas por avanços tecnológicos

que permitiram maior conhecimento do genoma humano e de outras

espécies animais, gerando a expectativa de que a manipulação

individual de genes possa ser um passo decisivo para a solução de

diversas doenças [Francis e cols 2001, Finkel 1999]. Devido à grande

susceptibilidade à manipulação genética, o camundongo, tornou-se

referência em estudos dos fatores moleculares envolvidos na

- 32 -

regulação de funções fisiológicas e na fisiopatogenia de doenças,

incluindo as do sistema cardiovascular [Bader e cols 2000, Cvetkovic

e Sigmund 2000, Dalloz e cols 2001, Ma e cols 2003]. Assim, torna-

se importante a caracterização dos fenômenos cardiovasculares nos

camundongos normais para que essa informação possa ser utilizada,

nos animais geneticamente modificados [Gassmann e Hennet 1998,

James e cols 1998].

Quanto ao sistema cardiocirculatório, estudos recentes

envolvendo modelos de camundongos geneticamente alterados têm

sido de grande importância para a avaliação dos efeitos de mutações

gênicas específicas sobre fenótipos, mecanismos eletrofisiológicos e

moleculares envolvidos na regulação do sistema cardiovascular

[Mansier e cols 1996, Jumrussirikul e cols 1998, Uechi e cols 1998,

Wickman e cols 1998, Stauss e cols 1999, Chen e cols 2005, Tank e

cols 2007]. Entretanto, embora exista uma relativa facilidade na

obtenção de manipulações genéticas em camundongos, o pequeno

porte físico desses animais dificulta, sobremaneira, a sua utilização,

principalmente em estudos que dependem de instrumentação

cirúrgica. Assim, muito do conhecimento obtido em animais de

experimentação tais como o rato, ou outras espécies maiores, ainda

não se encontra disponível em camundongos normais ou

geneticamente manipulados.

- 33 -

2. OBJETIVOS

- 34 -

- Avaliar, em ratos anestesiados, a redução da atividade do nervo

depressor aórtico após sua estimulação por dois mecanismos

distintos: (1) estimulação elétrica do segmento distal do nervo

(estimulação elétrica antidrômica) ou (2) aumento súbito da pressão

arterial pela coartação da aorta.

- Determinar a participação de espécies reativas de oxigênio e

derivados da enzima ciclooxigenase na depressão pós-estimulação do

nervo depressor aórtico em ratos.

- Caracterizar a depressão pós-estimulação do nervo depressor

aórtico em camundongos normais e avaliar a influência das espécies

reativas de oxigênio nesse fenômeno.

- 35 -

3. MATERIAL E MÉTODOS

- 36 -

Animais

No presente trabalho foram utilizados ratos da linhagem Wistar

(200-300g) e camundongos normais da linhagem C57Bl/6J (20-25g).

Os experimentos em ratos foram realizados no Departamento de

Fisiologia na Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto/USP, sendo os

animais fornecidos pelo Biotério Central do Campus da USP de

Ribeirão Preto. Os experimentos em camundongos foram realizados

no Centro de Pesquisa Cardiovascular na Universidade de Iowa, EUA

sob a supervisão do Dr. Mark W. Chapleau (durante o estágio de

doutorado sanduíche apoiado pelo CNPq - processo n° 210258/2006-

3). Os animais foram mantidos no biotério de ambas as instituições,

alimentados com ração granulada e água “ad libitum”, com ciclo

claro-escuro de 12 horas na temperatura de 21

o

C. Todos os

protocolos experimentais foram realizados de acordo com as normas

e princípios éticos de experimentação em animais de laboratório

estabelecidos pelo National Institutes of Health (NIH) Guide for the

Care and Use of Laboratory Animals [DHHS Publicatoin N°. (NIH) 80-

23, Revised 1996] e obtiveram aprovação do comitê de ética em

experimentação animal das duas instituições onde os experimentos

foram realizados, de acordo com o protocolo n

o

0028/2006 da FMRP

USP e 0802028 da Universidade de Iowa.

- 37 -

Drogas Utilizadas

- pentobarbital sódico (Sigma, St. Louis, MO, USA);

- indometacina (Sigma, St. Louis, MO, USA);

- catalase conjugada com polietileno glicol (PEG- Catalase, Sigma, St.

Louis, MO, USA).

Experimentos em Ratos

Instrumentação e Registros

Os experimentos em ratos foram executados sob efeito de

anestesia com pentobarbital sódico (40mg/kg de peso corporal, i.p.

Sigma, St. Louis, MO, USA). Doses suplementares de anestésico

foram administradas, quando necessário.

Todos os procedimentos cirúrgicos foram realizados sob visão

ampliada de um microscópio cirúrgico (MC- M2222, D.F. Vasconcelos,

São Paulo, SP, Brazil). A técnica cirúrgica consistiu de uma ampla

cervicotomia mediana e, em seguida, a traquéia foi canulada (PE-

240, Intramedic;

Becton Dickinson, Sparks, MD, USA) para facilitar a

respiração espontânea dos animais. Posteriormente, foi realizada

dissecção cuidadosa dos tecidos do pescoço para identificação e

isolamento do NDA esquerdo dos animais abaixo da sua junção com o

nervo laríngeo. Um cateter de polietileno (PE-50, Intramedic;

Becton

- 38 -

Dickinson, Sparks, MD, USA) preenchido com solução salina

heparinizada (50 U/mL) foi introduzido na carótida contralateral ao

NDA isolado para registro da PA pulsátil, simultaneamente com a

atividade do NDA. Outro cateter foi posicionado na veia femoral

esquerda para administração de drogas.

Após seu isolamento, o NDA foi colocado sobre um par de

eletrodos de aço inoxidável e seccionado rostralmente ao eletrodo. A

identificação da atividade barorreceptora foi confirmada pelas

despolarizações típicas dos barorreceptores visualizadas num

osciloscópio (trens de potenciais associados à fase sistólica da PA,

modelo 5113 Tektronix Inc, Beaverton, OR, EUA) e ouvidas num

sistema de som acoplado. No estudo, foram utilizados somente

animais que possuíam uma boa relação sinal/ruído. O sinal

proveniente dos eletrodos foi amplificado (amplificação diferencial,

Princeton Applied Research, Oak Ridge, TN, EUA). A cânula da

carótida foi conectada a um transdutor de pressão (Statham, P23 Gb,

Hato Hey, EUA), e a PA pulsátil, bem como a atividade do NDA

(Figura 3), foram digitalizadas por meio de uma interface de

conversão de sinal analógico para digital (DI-220, Dataq Inc, Akron,

OH, EUA), e amostradas (10 kHz) em um microcomputador, por meio

do programa computacional (Windaq, Dataq Inc, Akron, OH, EUA).

- 39 -

Coarctação da Aorta

Em um grupo de ratos, após as cateterizações e isolamento do

NDA, a cavidade abdominal foi aberta, e um segmento de ± 0,5 cm

da aorta, logo abaixo do diafragma, foi dissecado. Um oclusor

pneumático, construído com tubos de polietileno e membrana de

látex, segundo técnica descrita por Maio e colaboradores [1981] foi,

então, implantado ao redor da aorta abdominal, imediatamente acima

das emergências das artérias renais. Após a implantação do oclusor,

a laparotomia foi fechada e teve início o registro de PA e atividade do

NDA.

Estimulação Antidrômica do NDA

Uma chave comutadora foi especialmente construída para que o

eletrodo do NDA fosse conectado ao sistema de registro ou a um

estimulador elétrico (AVS-100 Grass, West Warwick, RI, EUA, em

camundongos ou AVS Projetos, São Paulo, SP, Brasil, em ratos).

Assim, foi possível, no meio de um registro, estimular eletricamente o

NDA, sem a necessidade de manipular esse nervo (Figura 6).

Os parâmetros utilizados para o estímulo elétrico foram os

seguintes: pulso de onda quadrada com intensidade de 5 V para rato

e 3 V para camundongo, duração de pulso de 2 ms, e freqüências de

10 a 100 Hz, aplicadas durante 10 s. Foi aguardado um tempo

- 40 -

mínimo de, pelo menos, 5 minutos entre cada estímulo, suficiente

para a atividade do NDA retornar ao seu valor basal.

Figura 6: Representação esquemática da preparação utilizada para

realizar a Estimulação Antidrômica do NDA.

Protocolos Experimentais

Protocolo 1

: Com os animais anestesiados (ratos, n=6), foram

realizados registros basais da atividade do NDA e PA durante 3

minutos. Em seguida, a PA foi elevada em 30 a 40 mmHg, por meio

- 41 -

da coarctação parcial da aorta, e mantida, nesse novo nível, por 10

minutos quando, então, a coarctação foi liberada o suficiente para

que a PA voltasse, rapidamente, a valores semelhantes ao basal (pré-

oclusão). O registro foi continuado por mais 5 minutos com a PA

mantida estritamente nos valores basais. Em torno de 5 minutos após

o final do da coarctação da aorta, com a atividade do NDA já

completamente recuperada, os ratos foram tratados com solução

salina (0,1 mL, iv) e o registro foi reiniciado. Após 3 minutos de

registro basal, o protocolo da coarctação da aorta foi repetido. Ao

final do experimento os ratos foram mortos por sobredose de

anestésico.

Protocolo 1A: O segundo protocolo realizado foi essencialmente

semelhante ao primeiro, exceto pelo fato da duração do período de

coarctação da aorta ter sido de apenas 3 minutos (ao invés de 10

minutos).

Protocolo 1B: O terceiro protocolo realizado foi essencialmente

semelhante ao segundo (coarctação da aorta por 3 minutos),

entretanto, ao invés de receberem salina entre as duas coarctações,

os ratos foram tratados com indometacina (5 mg/kg I.V., n=7),

catalase conjugada com polietileno glicol (PEG- Catalase, 10

4

U/kg

- 42 -

I.V., n=7) ou a combinação de ambos (PEG-Catalase e indometacina

10

4

U/kg e 5 mg/kg, respectivamente, I.V., n=6).

Protocolo 2: Em ratos anestesiados, foram feitos os registros basais

da atividade do NDA e PA durante 3 minutos. Na seqüência, foi

realizada a estimulação antidrômica do NDA (com freqüência de 20

Hz) e o registro continuado por mais 5 minutos. Então, grupos

distintos de ratos foram tratados com solução salina (NaCl 0,9%, 0,1

mL/100g I.V., n=6), indometacina (5 mg/kg I.V., n=7), catalase

conjugada com polietileno glicol (PEG - Catalase, 10

4

U/kg I.V., n=7)

ou ainda a associação de ambos (PEG-Catalase e indometacina 10

4

U/kg e 5 mg/kg respectivamente, I.V., n=7) e o registro foi

reiniciado. Após 3 minutos de registro basal, a estimulação

antidrômica do NDA foi repetida.

Experimentos em Camundongos

Instrumentação e Registros

Os experimentos conduzidos em camundongos foram realizados

de forma semelhante aos realizados em ratos. Os animais foram

anestesiados com pentobarbital sódico (40 μg/g de peso corporal, i.p.

Sigma, St. Louis, MO, USA). Doses extras de anestésico foram

- 43 -

administradas, quando necessário.

Todos os procedimentos cirúrgicos foram realizados sob visão

ampliada de um microscópio cirúrgico (Wild TYP 376788, Heerbrugg,

Switzerland). Foi realizada uma cervicotomia mediana e em seguida

a traquéia foi canulada (PE-90, Intramedic;

Becton Dickinson, Sparks,

MD, USA). Posteriormente, foi feita uma dissecção cuidadosa dos

tecidos do pescoço para identificação e isolamento do NDA esquerdo

dos animais abaixo da sua junção com o nervo laríngeo. Um cateter

de polietileno (PE-10 fundido no PE-50, Intramedic;

Becton Dickinson,

Sparks, MD, USA) preenchido com solução salina heparinizada (50

U/mL) foi introduzido na carótida contralateral ao NDA isolado para

registro da PA pulsátil simultaneamente com a atividade do NDA.

Outro cateter foi posicionado na jugular esquerda para administração

de drogas.

Após seu isolamento, o NDA foi colocado sobre um par de

eletrodos de aço inoxidável e seccionado rostralmente ao local onde o

eletrodo estava fixado. A identificação da atividade barorreceptora foi

confirmada pelas descargas típicas dos barorreceptores visualizadas

no osciloscópio (trens de potenciais associados à fase sistólica da PA,

modelo 5113 Tektronix Inc, Beaverton, OR, EUA) e ouvidas num

sistema de som acoplado. No estudo, foram utilizados somente

animais que possuíam uma boa relação sinal/ruído. O sinal

proveniente dos eletrodos foi amplificado (amplificação diferencial,

- 44 -

Princeton Applied Research, Oak Ridge, TN, USA). A cânula da

carótida foi conectada a um transdutor de pressão (Statham, P23 Gb,

Hato Hey, EUA), e a PA pulsátil, bem como a atividade do NDA, foram

registradas (10 kHz) em um microcomputador (Mac OS), acoplado a

um sistema de registro (MacLab/8s – LabChart, ADInstruments,

Castle Hill, Australia).

Protocolos Experimentais

Protocolo 1: Para avaliar a DPE em camundongos, foi realizado um

protocolo que consistia na aplicação da estimulação antidrômica do

NDA com freqüências variadas (n=5). Assim, após um registro basal

simultâneo da PA e atividade do NDA por 3 min, o nervo foi

estimulado, durante 10 s, com pulsos de onda quadrada com duração

de 2 ms, intensidade de 3 V e frequências de 10, 20, 40 e 80 Hz em

ordem aleatória, no mesmo animal. Após cada estimulação, o registro

continuou por 5 minutos. Pelo menos 3 minutos foram aguardados

entre cada estimulação.

Protocolo 1A: No segundo protocolo realizado em camundongos, a

estimulação antidrômica do NDA foi realizada, também por 10 s, com

pulsos de onda quadrada de 2 ms de duração, intensidade de 3 V,

mas apenas na freqüência de 20 Hz. O registro continuou por 5

- 45 -

minutos após o estímulo e, então os camundongos foram tratados

com solução salina (NaCl 0,9%, 0,1 mL/kg, I.V., n=5) ou catalase

conjugada com polietileno glicol (PEG - Catalase, 10

4

U/kg I.V., n=7).

Após o tratamento, um novo registro basal de 3 minutos foi realizado

e a estimulação do NDA foi repetida com os mesmos parâmetros. Ao

final dos experimentos, os camundongos foram mortos por sobredose

de anestésico.

3.6. Processamento dos registros

Os arquivos com os registros da PA e da atividade elétrica do

NDA foram analisados off line com auxílios dos programas

computacionais (Windaq e Advanced CODAS, Dataq Inc, Akron, OH,

EUA). Séries temporais, batimento a batimento, da PA média foram

geradas, pela detecção automática de seus valores. A atividade do

NDA foi retificada e integrada (integral de voltagem) a cada 10 ms.

Os valores da atividade do NDA durante o último terço da fase

descendente (diastólica) do pulso de pressão foram identificados e

tomados como ruído do registro. Então, após subtração do ruído, a

atividade do NDA foi integrada a cada batimento cardíaco. Por se

tratar de um registro extracelular da atividade elétrica de um

fascículo nervoso (multifibras), as séries temporais de atividade

integrada do NDA foram normalizadas em função de sua atividade

- 46 -

basal (basal = 100%), permitindo, assim, a comparação entre os

diferentes animais.

Estatística

Os resultados foram expressos como média ± erro padrão da média

(EPM). As medidas dos parâmetros fisiológicos foram comparadas por

meio da análise de variância de dois fatores, corrigida para medidas

repetidas. Quando diferenças foram observadas na análise de

variância, os tempos estudados foram comparados aos pares por

meio do teste de Tukey. As diferenças foram consideradas

significativas quando o valor de P foi menor ou igual a 0,05.

- 47 -

4. RESULTADOS

- 48 -

Estimulação dos Barorreceptores pela Coarctação da Aorta

Abdominal

A figura 7 apresenta traçados representativos de um animal,

mostrando alterações na PA e atividade do NDA promovidas pela

coarctação da aorta abdominal durante 10 minutos. Os ratos

submetidos a esse protocolo experimental (N=6) apresentaram PAM

basal de 110±5 mmHg e FC de 348±10 bpm. A coarctação da aorta

abdominal promoveu um súbito aumento da PAM para 147±7 mmHg,

valor que se manteve estável durante todo o período da coarctação.

Concomitantemente ao aumento da PA, observou-se uma elevação

da atividade do NDA de 74±8 % quando comparado ao período basal.

Imediatamente (5 s), após o súbito retorno da PA aos valores iniciais

(antes da coarctação), foi observada uma queda da atividade do NDA

para 70±8 % do basal, que retornou para valores basais em

aproximadamente 30 s (96±8 % do basal). Ou seja, a depressão

pós-estimulação dos barorreceptores (DPE) foi evidenciada quando os

mesmos foram estimulados pela elevação da PAM, por coarctação da

aorta, em ratos anestesiados. Ambas as sessões de coarctação da

aorta apresentaram resultados semelhantes (Figura 8), mostrando a

total reprodutibilidade do fenômeno.

- 49 -

Figura 7: Registro representativo da pressão arterial pulsátil (painel

superior), e atividade integrada do NDA (painel inferior), durante

hipertensão mantida (10 minutos) pela coarctação da aorta. Linha

branca representa a PA média.

- 50 -

PAM (mmHg)

50

100

150

200

Atividade do NDA (% basal)

50

100

150

200

tempo após coarctação (s)

0 30 60 90 120 180 240 300

1

a

coarctação

2

a

coarctação

*

*

*

*

Figura 8: Valores (Média±EPM) da PAM e atividade integrada do NDA

em ratos submetidos a hipertensão mantida (10 minutos) através da

coarctação da aorta abdominal (N=6). * p<0.05 comparado ao

período basal.

O estímulo dos barorreceptores por uma coarctação da aorta de

menor duração (3 min, N=6) produziu uma DPE semelhante àquela

induzida pela coarctação de 10 minutos (Figuras 9 e 10)

- 51 -

Pressão Arterial Média

90

110

130

150

Atividade Integrada do NDA

0

100

200

300

400

1 min

Coarctação

Aorta

Figura 9: Registro simultâneo da pressão arterial média, painel

superior, e atividade integrada do NDA, painel inferior, durante

hipertensão mantida (3 minutos) pela coarctação da aorta.

- 52 -

PAM (mmHg)

50

100

150

200

Atividade do NDA (% basal)

50

100

150

200

tempo após coarctação

0 30 60 90 120 180 240 300

10 min coarctação

3 min coarctação

*

*

*

Figura 10: Valores (Média±EPM) da PAM e da atividade integrada do

NDA em ratos submetidos a hipertensão mantida por 10 (N=6) e 3

(N=3) minutos através da coarctação da aorta abdominal. * p<0.05

comparado ao período basal.

A administração de solução salina isotônica entre os 2 episódios

de coarctação da aorta (3 min, N=3) levou a uma tendência de

elevação na PAM basal dos ratos (86±6 vs. 99±4 mmHg, p = 0,051).

Entretanto, tanto a resposta hipertensora, como o aumento da

atividade do NDA, assim como a DPE do NDA foram semelhantes

entre os 2 episódios de coarctação da aorta (figura 11). Tanto antes,

- 53 -

como após a administração de solução salina, 30 s após o final da

coarctação, a atividade do NDA já havia retornado aos valores

semelhantes ao do período basal (89±8 e 99±8 %).

PAM (mmHg)

50

100

150

200

Atividade do NDA (% basal)

50

100

150

200

0 30 60 90 120 180 240 300

basal

após salina

*

*

Figura 11: Valores (Média±EPM) da PAM e atividade integrada do

NDA em ratos submetidos a hipertensão mantida (3 minutos) através

da coarctação da aorta abdominal (N=3). * p<0.05 comparado ao

período basal.

No grupo de animais tratados com PEG-catalse entre os 2

episódios de coarctação, a PAM basal não sofreu alteração (110±7 e

117±7 mmHg antes e após a catalase, respectivamente). Também,

- 54 -

tanto o aumento da PA como a ativação do NDA foram semelhantes

entre os 2 episódios de coarctação da aorta (figura 12). Na primeira

coarctação (antes da catalase), ocorreu a DPE do NDA, ou seja, a

atividade do NDA foi reduzida (61±5 % do basal) 5 s após a PAM ter

retornado ao nível basal, com recuperação completa da mesma

(91±5 % do basal) após 30 s. Entretanto, depois de administrada a

catalase, a queda na atividade do NDA após a coarctação da aorta

abdominal foi completamente bloqueada (97±3 e 104±1 % do basal

5 e 30 segundos após a coarctação, respectivamente). A figura 12

ilustra o efeito da catalase sobre DPE induzida pela coarctação da

aorta em ratos anestesiados.

- 55 -

PAM (mmHg)

50

100

150

200

Atividade do NDA (% basal)

50

100

150

200

tempo após coarctação

0 50 100 150 200 250 300

basal

após catalase

*

τ

*

τ

τ

Figura 12: Valores (Média±EPM) da PAM e atividade integrada do

NDA em ratos submetidos a hipertensão mantida (3 minutos) através

da coarctação da aorta abdominal antes e após PEG-catalase (N=6).

* p<0.05 comparado ao período basal. τ p<0.05 comparado ao

mesmo momento antes da droga ou salina.

A administração de indometacina entre os 2 episódios de

coarctação (N=5) não alterou a PAM basal (106±5 e 109±6 antes e

após indometacina, respectivamente). Entretanto, a indometacina

aumentou a duração do fenômeno de DPE do NDA induzida pela

coarctação da aorta (figura 13). Embora a queda da atividade do NDA

- 56 -

tenha sido semelhante antes (60 ± 4 % do basal) e após

indometacina (55 ± 4 % do basal), nos animais que receberam

indometacina, a recuperação da DPE foi marcadamente retardada, de

modo que, mesmo 60 s após o término da coarctação, os animais

mantinham a atividade do NDA inferior ao período basal (90±5 % do

basal). A figura 13 ilustra o efeito da indometacina sobre DPE

induzida pela coarctação da aorta em ratos anestesiados.

PAM (mmHg)

50

100

150

200

Atividade do NDA (% basal)

50

100

150

200

tempo após estímulo

0 30 60 90 120 180 240 300

basal

após indometacina

*

*

*

*

*

*

τ

τ

Figura 13: Valores (Média±EPM) da PAM e atividade integrada do

NDA em ratos submetidos a hipertensão mantida (3 minutos) através

da coarctação da aorta abdominal antes e após indometacina (N=5).

* p<0.05 comparado ao período basal. τ p<0.05 comparado ao

- 57 -

mesmo momento antes da administração da droga ou salina.

No grupo de animais no qual foi administrada PEG-catalase e

indometacina juntas, houve uma elevação significativa da PAM após a

administração das drogas (116±5 vs. 130±3 mmHg, p<0,05). Como

esperado, a resposta da atividade do NDA antes da administração das

drogas seguiu o mesmo padrão dos outros grupos, ou seja, uma

queda inicial (5 s) da atividade (62±7 % do basal), se recuperando

parcialmente aos 30 segundos (86±3 % do basal) e estando

totalmente recuperada aos 60 segundos (95±3 % do basal).

Entretanto, semelhante ao ocorrido no grupo de animais que só

recebeu PEG-catalase, a associação das duas drogas (PEG-catalase e

indometacina) aboliu completamente a DPE (97±4 e 94±3 % do

basal 5 e 30 s após a coarctação, figura 14).

- 58 -

PAM (mmHg)

50

100

150

200

Atividade do NDA (% basal)

50

100

150

200

tempo após estímulo

0 50 100 150 200 250 300

basal

após indometacina + catalase

*

*

τ

τ

τ

Figura 14: Valores (Média±EPM) da PAM e atividade integrada do

NDA em ratos submetidos a hipertensão mantida (3 minutos) através

da coarctação da aorta abdominal antes e após PEG catalase +

indometacina (N=5). * p<0.05 comparado ao período basal. τ p<0.05

comparado ao mesmo momento antes da administração da droga ou

salina.

Estimulação Elétrica Antidrômica do Nervo Depressor Aórtico

As figuras 15 e 16 ilustram o efeito da estimulação elétrica

antidrômica do NDA sobre a PA e a atividade espontânea deste nervo.

- 59 -

Figura 15: Registro simultâneo da pressão arterial e atividade do

NDA antes (basal) e após estimulação antidrômica do NDA (seta).

- 60 -

50

100

PRESSÃO ARTERIAL

(mmHg)

150

0

100

ATIVIDADENDAINTEGRADA

(%atividade basal)

200

30s

Estimulação NDA

(5V,20Hz)

Figura 16: Pressão arterial e atividade Integrada do nervo depressor

aórtico de um rato, antes (basal) e após a estimulação antidrômica

do NDA.

A figura 17 mostra o resultado da estimulação antidrômica do

NDA sobre a PA e atividade elétrica deste nervo nos ratos avaliados

no presente estudo (N=26). Não foi observada qualquer alteração

significativa da PA, que se manteve dentro de uma faixa de variação

extremamente estreita, antes, durante e após a estimulação elétrica

antidrômica do NDA. Entretanto, uma drástica redução da atividade

do NDA, para 13±3 % do basal foi observada imediatamente (5

s) após sua estimulação elétrica. Ou seja, assim como quando a

atividade do NDA foi estimulada pela elevação da PA (coarctação da

- 61 -

aorta), a estimulação elétrica antidrômica do NDA também produziu

uma exuberante DPE. Aproximadamente 2 min foram necessários

para que a atividade do NDA retornasse aos níveis observados antes

da estimulação elétrica do nervo.

*

*

*

*

PAM (mmHg)

50

100

150

200

Atividade do NDA (% basal)

0

50

100

150

tempo após estimulação (s)

0 30 60 90 120 180 240 300

*

*

*

*

*

Figura 17: Valores (Média±EPM) da PAM e atividade integrada do

NDA dos ratos submetidos a estimulação antidrômica do NDA

(N=26). * p<0.05 comparado ao período basal.

A figura 18 ilustra o efeito da administração de solução salina

isotônica entre os 2 episódios de estimulação elétrica do NDA. O

- 62 -

tratamento com salina não determinou qualquer alteração nos

valores basais da PAM (144±7 e 146±6 mmHg), assim como não

alterou o padrão da DPE induzida pela estimulação elétrica do NDA

(19±2 vs. 22±1 % do basal antes e após tratamento com salina,

respectivamente). A recuperação completa da atividade do NDA

ocorreu aproximadamente 2 min após o estímulo elétrico.

*

*

*

*

PAM (mmHg)

50

100

150

200

Atividade do NDA (% basal)

0

50

100

150

tempo após estimulação (s)

0 30 60 90 120 180 240

basal

após salina

*

*

*

*

*

*

*

*

Figura 18: Valores (Média±EPM) da PAM e atividade integrada do

NDA em ratos submetidos a estimulação antidrômica do NDA antes e

após salina (N=6). * p<0.05 comparado ao período basal.

- 63 -

O efeito do tratamento com PEG-catalase sobre a PDE está

ilustrado na figura 19. A PAM basal foi semelhante antes (138±3

mmHg) e após administração de PEG-catalase (143±4 mmHg). Assim

como na coarctação da aorta, com a estimulação elétrica, a

administração de PEG-catalase também bloqueou completamente a

DPE da atividade do NDA (18±10 vs. 95±6 % do basal, antes e após

o tratamento com catalase, 5 s após a estimulação).

- 64 -

*

*

*

*

PAM (mmHg)

50

100

150

200

Atividade do NDA (% basal)

0

50

100

150

tempo após estimulação (s)

0 30 60 90 120 180 240 300

basal

após catalase

*

*

*

*

*

*

τ

τ

τ

τ

τ

Figura 19: Valores (Média±EPM) da PAM e atividade integrada do

NDA em ratos submetidos a estimulação antidrômica do NDA antes e

após PEG-catalase (N=7). * p<0.05 comparado ao período basal. τ

p<0.05 comparado ao mesmo momento antes da administração da

droga ou salina.

A Figura 20 ilustra o resultado da estimulação antidrômica do

NDA sobre a atividade deste nervo e a PAM antes e após o

tratamento dos ratos com indometacina. A PAM basal não foi alterada

pela indometacina (136±4 vs. 137±3 mmHg). Entretanto, o efeito da

indometacina sobre a DPE induzida pela estimulação elétrica do

- 65 -

nervo, também foi semelhante àquele observado com a DPE induzida

pela coarctação da aorta. Ou seja, a magnitude da inibição da

atividade do NDA foi semelhante antes (9 ± 4 % do basal) e depois

do tratamento com indometacina (11 ± 1 % do basal), mas a

recuperação da DPE foi significativamente retardada após a droga.

Atividade do NDA (% basal)

0

50

100

150

tempo após estimulação (s)

0 30 60 90 120 180 240

basal

após indometacina

*

*

*

*

PAM (mmHg)

50

100

150

200

*

*

*

*

*

τ

τ

τ

*

*

*

*

Figura 20: Valores (Média±EPM) da PAM e atividade integrada do

NDA em ratos submetidos a estimulação antidrômica do NDA antes e

após indometacina (N=7). * p<0.05 comparado ao período basal. τ

p<0.05 comparado ao mesmo momento antes da administração da

droga ou salina.

- 66 -

Os resultados do tratamento dos ratos com a associação entre

PEG-catalase e indometacina estão representados na figura 21. A

combinação dessas drogas não alterou a PAM basal (133±3 e 139±5

mmHg antes e após a administração das drogas em conjunto,

respectivamente). Entretanto, a magnitude da DPE observada após

estimulação elétrica do NDA foi menor (34±4 % do basal) após o

tratamento com PEG-catalase e indometacina e, praticamente, não

houve recuperação dessa atividade no período estudado.

- 67 -

*

*

*

*

PAM (mmHg)

50

100

150

200

Atividade do NDA (% basal)

0

50

100

150

tempo após estimulação (s)

0 30 60 90 120 180 240 300

basal

após catalase + indometacina

*

*

*

*

*

*

*

*

*

*

*

*

*

τ

τ

τ

τ

ττ

Figura 21: Valores (Média±EPM) da PAM e atividade integrada do

NDA em ratos submetidos a estimulação antidrômica do NDA antes e

após associação da PEG-catalase e indometacina (N=7). * p<0.05

comparado ao período basal. τ p<0.05 comparado ao mesmo

momento antes da administração da droga ou salina.

Estimulação Elétrica Antidrômica do NDA em Camundongos

Em camundongos, a estimulação elétrica antidrômica do NDA

também produziu uma inibição da atividade deste nervo, sem causar

qualquer alteração na PAM.

Os resultados da estimulação elétrica antidrômica feita em

- 68 -

diferentes frequências no NDA de camundongos (N=5) estão

apresentados na figura 22. Nesses animais, observamos que 5 s após

o estímulo elétrico houve uma queda na atividade do NDA em todas

as frequências testadas, porém a recuperação da atividade do nervo

após o estímulo nas frequências mais altas (40 e 80 Hz) ocorreu mais

rapidamente, retornando aos seus valores basais em 30 s, enquanto

que, em estímulos com freqüências mais baixas (10 e 20 Hz), a

recuperação aconteceu em aproximadamente 2 min.

PAM (mmHg)

50

75

100

Atividade do NDA (% basal)

0

50

100

150

tempo após estimulação (s)

0 30 60 90 120 180 240

10 Hz

20 Hz

40 Hz

80 Hz

Figura 22: Valores (Média±EPM) da atividade integrada do NDA em

camundongos estimulados com várias freqüências (N= 5).

- 69 -

Não foi observada diferença entre os resultados obtidos com o

primeiro ou o segundo estímulo elétrico (após salina).

*

*

*

*

PAM (mmHg)

50

100

150

200

Atividade do NDA (% basal)

0

50

100

150

tempo após estimulação (s)

0 30 60 90 120 180 240

1

a

estimulação

2

a

estimulação

*

*

*

*

*

*

Figura 23: Valores (Média±EPM) da PAM e atividade integrada do

NDA em camundongos (n= 6).

A Figura 24 ilustra o resultado da estimulação antidrômica do

NDA sobre a atividade deste nervo e a PAM antes e após o

tratamento dos camundongos com PEG-catalase. A PAM basal não foi

alterada pela catalase (75±6 vs. 75±7 mmHg). Entretanto, o efeito

da catalase sobre a DPE induzida pela estimulação elétrica do nervo

em camundongo foi semelhante àquele observado em ratos. Ou seja,

- 70 -

a magnitude da inibição da atividade do NDA foi abolida após a droga

(100 ± 4 % do basal) quando comparado à estimulação controle (50

± 6 % do basal).

*

*

*

*

PAM (mmHg)

50

100

150

200

Atividade do NDA (% basal)

0

50

100

150

tempo após estimulação (s)

0 30 60 90 120 180 240

basal

após catalase

*

*

*

*

τ

*

τ

τ

τ

Figura 24: Valores (Média±EPM) da PAM e atividade integrada do

NDA em ratos submetidos a estimulação antidrômica do NDA antes e

após PEG-catalase (N=7). * p<0.05 comparado ao período basal. τ

p<0.05 comparado ao mesmo momento antes da administração da

droga ou salina.

- 71 -

5. DISCUSSÃO

- 72 -

O presente estudo teve como objetivo avaliar, em ratos

anestesiados, fatores potencialmente envolvidos no fenômeno da

DPE. O papel de radicais livres de oxigênio e prostanóides derivados

da enzima ciclooxigenase foram avaliados pelo tratamento dos ratos

com catalase, um quelante de radicais livres ou indometacina, um

inibidor da ciclooxigenase.

A presença de uma inibição após a estimulação dos

barorreceptores por elevação da PA é um fenômeno conhecido [Bronk

e Stella 1935, Landgren 1952, Franz 1969], entretanto os

mecanismos responsáveis por essa inibição pós-estimulação

permanecem por serem elucidados. Essa redução excessiva da

atividade dos barorreceptores, evidenciada sempre que a PA retorna

abruptamente para valores normais, pode ser decorrente

exclusivamente da adaptação rápida que os barorreceptres sofrem

durante o período hipertensivo. Entretanto, existem evidências de

que a DPE pode ter a participação de fatores independentes àqueles

envolvidos na adaptação dos barorreceptores [Nakajima 1966,

Nakajima 1969a, Nakajima 1969b, Saum e cols, 1976].

A estimulação elétrica do NDA não causou qualquer alteração

na PA dos animais estudados. A lesão da conexão entre o NDA e o

sistema nervoso central foi eficiente em determinar que o estimulo

elétrico aplicado ao nervo atingisse apenas os terminais

barorreceptores (estimulação antidrômica). A grande inibição

- 73 -

observada na atividade do NDA após a sua estimulação elétrica, sem

qualquer alteração da PA, sugere, fortemente, que fatores humorais

que influenciam a atividade do NDA podem ser liberados no próprio

nervo ou nos terminais barorreceptores.

A magnitude da DPE foi significativamente maior quando o

nervo foi estimulado eletricamente, em relação ao estímulo dos

barorreceptores provocado pelo aumento da PA. É impossível se

comparar o grau de ativação do NDA com estímulos de natureza tão

diferente como a estimulação elétrica antidrômica do NDA e o

aumento da PA. Assim, estímulos distintos podem resultar em graus

também distintos de DPE.

A duração maior (10 min) ou menor (3 min) da coarctação da

aorta não teve influência na magnitude ou duração da DPE. É

amplamente conhecido que a manutenção da PA em nível elevado

promove a adaptação dos barorreceptores [Chapleau e cols 1988b,

Salgado e Machado 1991, Salgado e cols 2004], e esse fenômeno

deve estar envolvido na gênese ou na modulação da DPE quando a

PA retorna subitamente ao normal. A magnitude da adaptação dos

barorreceptores é fortemente influenciada pelo tempo de hipertensão

mantida [Chapleau e cols 1988b, Salgado e Machado 1991, Salgado e

cols 2004], entretanto, dentro da janela temporal utilizada no

presente estudo (3 ou 10 min), a DPE não foi diferente.

É amplamente conhecido que mecanismos regulatórios agem no

- 74 -

intuito de restaurar a PA quando são executadas manobras como a

coarctação da aorta. Além disso, as substâncias químicas liberadas no

intuito de restaurar a PA podem interferir na atividade dos

barorreceptores [Li e Chapleau 1995]. Assim, para minimizar uma

possível influência de substâncias liberadas pelos sistemas

regulatórios, que poderiam interferir na resposta dos barorreceptores

[O'Donnell 1992] à sua estimulação, optou-se por utilizar um menor

tempo de coarctação. Além disso, o perfil semelhante de inibição da

atividade do NDA apresentado pelos animais submetidos à coarctação

mais duradoura (10 minutos) ou mais rápida (3 minutos) forneceu a

base necessária para utilização do menor tempo de coarctação nos

protocolos seguintes.

A comparação entre as duas formas de estímulo também

mostra dados interessantes. A estimulação elétrica produz uma

inibição mais prolongada quando comparada a coarctação da aorta.

Com essa resposta mais pronunciada causada pela estimulação

elétrica, é possível analisar melhor o desenvolvimento e recuperação

da DPE. Além disso, foi demonstrado que a estimulação da porção

distal do NDA após a destruição da sua conexão central não altera a

PA, mas inibe significantemente a atividade do NDA por 2 minutos.

Existem evidências de que essa inibição é dependente da estimulação

de fibras do tipo C [Davis e cols, 1998]. Assim, a estimulação elétrica

pode ser considerada uma ferramenta útil para se diferenciar os

- 75 -

fenômenos de origem neural daqueles ocasionados pelas

propriedades viscoelásticas da parede endotelial que possam

influenciar a DPE.

O mecanismo primário de ativação dos barorreceptores é a

deformação mecânica da parede vascular [Chapleau e cols, 1995].

Entretanto, diversos outros fatores podem interferir na atividade dos

mesmos, modulando sua atividade [Chapleau e cols 1991, Li e cols

1997, Salgado e cols 2006]. A liberação de substâncias químicas

pelas próprias terminações barorreceptoras pode atuar alterando a

atividade do NDA e influenciando a inibição desse nervo após breves

períodos de estimulação [McDowell e cols, 1989; Chapleau e cols,

1991]. Alguns autores propõem que a ativação de canais de potássio

sensíveis a 4-aminopiridina [Chapleau e cols, 1991] contribui para

adaptação dos baroreceptores, enquanto a ativação da bomba Na

+

/K

+

[Saum e cols, 1976] tem efeito sobre a DPE. Entretanto, essas

evidências foram obtidas em preparações isoladas do seio carotídeo.

Assim, o presente estudo é o primeiro a examinar, in vivo, a

participação de eventuais fatores autócrinos, potencialmente

liberados nas próprias terminações barorreceptoras, envolvidos na

modulação da atividade do NDA.

É importante salientar que a DPE, quando avaliada em

camundongos, apresentou-se de forma semelhante ao observado em

ratos. É sabido que a estimulação elétricado NDA com baixas

- 76 -

frequências promove uma ativação tanto de fibras do tipo A (mais

grossas e mielinizadas) como também do tipo C (mais finas e pouco

mielinizadas) [Fan e Andresen 1998]. Assim, a estimulação de fibras

A em conjunto com as fibras C, em camundongo, apresentam uma

maior resposta da DPE quando comparado a estimulação de fibras A

isoladas. Essa resposta mais acentuada também foi observada em

ratos [Davies e cols 1998], demonstrando que há uma participação

importante das fibras C na gênese da DPE.

Espécies reativas de oxigênio (ROS) constituem uma família de

moléculas com marcantes efeitos sobre a função celular [Griendling e

cols, 2000]. Com relação ao sistema cardiocirculatório e, em especial,

na hipertensão arterial, é bem estabelecido que há uma participação

importante das ROS [Cai e Harrison 2000, Redon e cols 2003,

Paravicini e Touyz 2006, Lee e Griendling 2008]. Indivíduos com

hipertensão arterial apresentam níveis elevados de bioprodutos do

estresse oxidativo associados a uma redução na atividade de enzimas

antioxidantes endógenas no sangue e em células mononucleares

[Redon e cols 2003]. Além disso, há evidências que as ROS exercem

uma ação importante nas células que compõem a parede dos vasos

[Lee e Griendling 2008, Paravicini e Touyz 2006].

Assim, no presente estudo, a ação desenvolvida pelas ROS, em

especial o H

2

O

2

, na gênese da DPE do nervo depressor aórtico foi

avaliada pela administração de PEG-Catalase, droga que diminui a

- 77 -

concentração de H

2

O

2

, previamente à coarctação da aorta abdominal,

em ratos, ou estimulação elétrica antidrômica do nervo depressor

aórtico, em ratos e camundongos. Com esse protocolo, foi possível

observar que a administração de PEG-Catalase aboliu completamente

a inibição transitória da atividade do NDA após coarctação da aorta

abdominal ou estimulação elétrica antidrômica do NDA em ambos os

modelos animais utilizados. Esses achados sugerem fortemente que o

H

2

O

2

pode ser liberado nas terminações barorreceptoras quando

essas estruturas são estimuladas, inibindo transitoriamente a

atividade dos mesmos.

O H

2

O

2

tem sido descrito como um potente fator

hiperpolarizante derivado do endotélio devido a sua habilidade em

ativar canais de potássio na musculatura vascular [Sobey e cols

1997, Iida e Katusic 2000, Matoba e cols 2000]. Outro tipo de canal

iônico também descrito como sendo ativado pelo H

2

O

2

nos leitos

vasculares é o canal de cálcio ativado por potássio [Sobey e cols

1997, Iida e Katusic 2000, Matoba e cols 2000]. Uma característica

importante do H

2

O

2

na gênese da DPE é sua ação aumentando a

atividade da bomba de Na

+

/K

+

[Rounds e cols 1998]. Saum e

colaboradores [1976] demonstraram que, em preparação isolada do

arco aórtico, quando realizavam uma elevação da PA por breves

períodos e, em seguida, a PA era reduzida para valores semelhantes

ao do período basal, ocorria a DPE, sendo que, após a administração

- 78 -

de oubaína (bloqueador da atividade da bomba Na

+

/K

+

) ao banho,

este fenômeno foi totalmente bloqueado.

Os resultados do presente estudo corroboram estudos em

preparação isolada [Snitsarev e cols 2005] mostrando que a DPE dos

barorreceptores in vivo conta com a importante participação de ROS.

No presente estudo, além da avaliação da participação de ROS

na DPE da atividade do NDA, avaliou-se, também, a influência de

possíveis fatores produtos da enzima ciclooxigenase (COX) na

recuperação da atividade do NDA após a coarctação da aorta ou

estimulação elétrica antidrômica do NDA em ratos. Nesse protocolo,

foi utilizada indometacina como bloqueador da síntese da COX.

A administração intravenosa de indometacina não afetou a

inibição da atividade do NDA em resposta aos estímulos ativadores

dos barorreceptores, mas a indometacina aumentou o período de

inibição da atividade do NDA em resposta aos estímulos,

demonstrando a participação de metabólitos da COX ativando os

barorreceptores e, assim, auxiliando na recuperação da atividade

após sua inibição.

Dentre os vários metabólitos produzidos pela síntese da COX,

alguns estudos da função barorreceptora suportam que a PGI

2

pode

ser o principal fator liberado pelas terminações barorreceptoras que

influenciam diretamente no processo de recuperação da atividade dos

barorreceptores após a DPE [Chapleau e cols 1991(B), Snitsarev e

- 79 -

cols 2005]. Em preparação isolada do seio carotídeo de coelhos com

hipertensão renal crônica, a síntese de PGI

2

do ácido aracdônico

estava significativamente reduzida, causando uma diminuição na

sensibilidade dos barorreceptores [Xie e cols 1990, Chapleau e cols

1991]. Além disso, vários autores já demonstraram que PGI

2

pode

ativar neurônios sensoriais [Smith e cols 1991, Kwong e Lee 2002,

Harada e cols 2002]. Além disso, há evidências de que, durante o

aumento na tensão da parede vascular causado pelo aumento na PA,

a liberação de PGI

2

pelo endotélio também se encontra elevada

[Mombuli e Vanhoutte 1999]. Para determinar se a liberação de PGI

2

,

substância fundamental para restaurar atividade do nervo no terminal

barorreceptor, dependia do endotélio, foi realizado o protocolo de

ativação dos barorreceptores com e sem alteração da PA. E, de

acordo com os achados, é possível observar que a liberação de PGI

2

pelas terminações dos barorreceptores se deu por um mecanismo

que não foi devido ao aumento da tensão da parede vascular. Embora

a forma mais comum de liberação da PGI

2

esteja relacionada com

alteração na tensão da parede vascular [Mombuli e Vanhoutte 1999],

no protocolo em que foi realizada a estimulação antidrômica do NDA,

não houve alteração na PA e, conseqüentemente, não houve

alteração das propriedades visco-elásticas da parede vascular. Esse

resultado corrobora dados da literatura em que, em preparação

isolada do seio carotídeo de cães anestesiados, o limiar de ativação

- 80 -

dos barorreceptores a altas pressões estava preservado na presença

de indometacina, mesmo com o endotélio ausente [Wang e cols

1993]. Além disso, estudos anteriores mostram que a indometacina,

quando utilizada em preparações isoladas do seio carotídeo desloca a

curva de atividade dos barorreceptores para valores mais altos de

pressão, sem alterar o diâmetro vascular [Xie e cols 1990]. Assim, a

preparação utilizada nesse estudo permite avaliar a adaptação dos

barorreceptores em circunstâncias que não envolvem alteração na

PA.

Também pode ser evidenciado que as PGI

2

não exerceram

influência tônica na atividade do NDA, haja vista que, com a

administração de indometacina, não foi observada alteração na

atividade basal do NDA. Entretanto, como pode ser visto nos

resultados, após a estimulação antidrômica do NDA, a PGI

2

se tornou

essencial para restaurar a atividade do NDA. Esse dado corrobora

resultados de Snitsarev e cols [2005], no qual, em células isoladas do

gânglio nodoso, foi avaliada a produção de PGI

2

antes e após serem

estimuladas eletricamente. Esses autores observaram que, antes do

estímulo, a produção de PGI

2

era ínfima, porém, após a estimulação

elétrica, havia um aumento significativo na produção de PGI

2

por

essas células, aumento este que foi bloqueado pela adição de

indometacina ao banho. Baseado nesses dados, sugere-se que, após

a estimulação dos barorreceptores por ambos os estímulos, ocorreu

- 81 -

uma produção e liberação de PGI

2

nas terminações barorreceptoras

na tentativa de restaurar a atividade basal do NDA. É importante

ressaltar também, que a queda na atividade do NDA após a

administração de indometacina não é devida a uma perda da

responsividade do nervo a uma segunda estimulação do NDA pois,

em ambos os protocolos de estímulo, quando foi realizado o grupo

controle (antes e após a administração de salina), o padrão de

resposta do nervo foi o mesmo.

Assim, baseado nos resultados do presente estudo, pode-se

inferir que o H

2

O

2

produzido e liberado durante a ativação das

aferências barorreceptoras tem importante papel na gênese da DPE

dos barorreceptores, enquanto a PGI

2

, também produzida e liberada

durante a estimulação das aferências barorreceptoras, age no sentido

de restaurar a atividade basal dos mesmos. Mesmo que em situação

basal, o H

2

O

2

e as PGI

2

não modulam a excitabilidade das fibras

barorreceptoras, a produção e liberação de H

2

O

2

durante a

estimulação das aferências barorreceptoras é considerável e, através

de ações sobre canais iônicos, essa substâncias podem afetar a

atividade dos barorreceptores. Além disso, a produção neuronal de

PGI

2

nas próprias terminações barorreceptoras age no sentido de

reverter a DPE, restaurando a atividade basal dos barorreceptores.

Corroborando estudos prévios [Xie e cols 1990, Chapleau e cols

1991, Smith e cols 1991, Cai e Harrison 2000, Kwong e Lee 2002,

- 82 -

Harada e cols 2002, Paravicini e Touyz 2006, Lee e cols 2008],

nossos dados suportam a hipótese de que uma falha na produção de

PGI

2

neuronal associada a um aumento na produção de H

2

O

2

contribuem para a redução da sensibilidade dos barorreceptores,

situação que é comum em diversos estados patológicos, inclusive na

hipertensão.

A redução na atividade dos barorreceptores após sua

estimulação pode ser comparada, por analogia, ao fenômeno de

adaptação da atividade dos barorreceptores à hipertensão mantida.

Assim, a adaptação dos barorreceptores pode estar associada ao

aumento na produção de H

2

O

2

. Contudo, a fonte de liberação de H

2

O

2

responsável pela inibição da atividade dos barorreceptores não pode

ser determinada a partir dos nossos dados, entretanto com essa nova

metodologia, tem-se a oportunidade de usar agentes farmacológicos

específicos para locais de produção de H

2

O

2

. Ainda, a caracterização

da DPE após a estimullação antidrômica do NDA em camundongos

produz a base necessaria para se utilizar, em estudos futuros,

animais geneticamente modificados na tentativa de se avaliar a

participação de diferentes estruturas que, sabidamente, causam

aumento no estresse oxidativo, e que possam participar da gênese da

DPE dos barorreceptores.

- 83 -

6. Resumo

A atividade dos barorreceptores é transitoriamente inibida após

breves períodos de aumento na pressão arterial ou curtos períodos de

estimulação elétrica das aferências barorreceptoras. Esse fenômeno é

denominado “depressão pós-estimulação (DPE)”. Fatores inibitórios,

com espécies reativas de oxigênio, e excitatórios, como os

metabólitos da ciclooxigenase (COX), podem ser liberados das

terminações barorreceptoras durante sua ativação, podendo modular

a DPE. Avaliamos a hipótese que o bloqueio da produção de peróxido

de hidrogênio (H

2

O

2

) pela administração de PEG-catalase abole a DPE

enquanto que o bloqueio da produção de metabólitos da COX com a

indometacina retarda a recuperação da DPE após a ativação dos

barorreceptores com a oclusão da aorta abdominal ou estimulação

antidrômica das terminações barorreceptoras in vivo. A atividade

aferente dos barorreceptores foi avaliada pela atividade do nervo

depressor aórtico em ratos Wistar anestesiados com tiopental sódico

(40 mg/kg, ip) antes e após curtos períodos (10 ou 3 minutos) de

coarctação da aorta abdominal ou estimulação antidrômica do nervo

depressor aórtico (5 V, 2 ms, 20 Hz por 10 s). O protocolo de

estimulação também foi realizado em camundongos c57/Bl. Em

ambos os protocolos, a porção cranial do nervo depressor aórtico foi

seccionada antes de se iniciar o protocolo para evitar alterações

reflexas na pressão arterial. Os protocolos foram realizados antes e

após a administração do inibidor da COX, indometacina (5 mg/kg, iv,

somente em ratos), quelante de H

2

O

2

PEG-catalase (10

4

U/kg, IV, em

ratos e camundongos) ou salina (0.1 mL/100 g, iv). Não foram

observadas diferenças no padrão de resposta da atividade do nervo

depressor aórtico entre a coarctação de 10 ou 3 minutos. Foi

observada uma redução na atividade dos barorreceptores para 60±10

% do basal, imediatamente (5 s) após o retorno da pressão arterial a

- 84 -

valores normais após a coarctação da aorta abdominal. Houve uma

recuperação da atividade do NDA para 89±8 e 106±3 % do basal aos

30 e 60 s após o estímulo. Tanto a magnitude, como a duração da

DPE não foram alteradas após a administração de salina. A DPE foi

significantemente potencializada pela a administração de

indometacina (77±6 e 90±5 % do basal 30 e 60 s após a coarctação

da aorta), mas foi abolida pela administração de PEG-catalase (97±3

e 108±3 % do basal 5 e 60 s após a coarctação da aorta). Quando a

indometacina foi administrada junto com a PEG-catalase, a DPE

também foi abolida (97±4 e 103±3 % do basal 5 e 60 s após a

coarctação da aorta). No protocolo de estimulação elétrica, foi

observada uma grande queda na atividade dos barorreceptores após

sua estimulação, chegando a valores de 19±2 % da atividade basal,

imediatamente (5s) após a estimulação elétrica do nervo depressor

aórtico, não sendo associada a alterações na pressão arterial. Houve

uma recuperação da atividade dos barorreceptores para 69±3 e 92±3

% do basal aos 60 e 120 s após o estímulo. Semelhante ao protocolo

anterior, a DPE não foi alterada pela administração de salina. A DPE

foi significantemente prolongada pela indometacina (43±6 e 49±8 %

do basal aos 60 e 120 s após a estimulação dos barorreceptores) e

completamente abolida pela administração de PEG-catalase (95±6 e

107±8 % do basal aos 5 e 60s). A administração conjunta de

indometacina e PEG-catalse promoveu uma redução da atividade dos

barorreceptores, após sua ativação, de intensidade menor quando

comparado ao controle (34±4 % do basal 5 s após sua estimulação),

porém não houve uma recuperação da atividade dos barorreceptores

no período estudado, permanecendo em patamar inferior até o final

do experimento (60±7% do basal 300 s após sua estimulação). Os

experimentos em camundongos tiveram o mesmo comportamento

dos realizados com ratos.

- 85 -

7.Abstract

Baroreceptor activity is inhibited transiently after brief periods of

increased arterial pressure or electrical stimulation of baroreceptor

afferents. This phenomenon is referred as “post-excitatory

depression” (PED). It has been suggested that inhibitory factors like

reactive oxygen species and excitatory factors like cyclooxygenase

(COX) metabolites may be released from baroreceptor endings during

its activation and may modulate the development of PED. In the

present study, we tested the hypothesis that blockade of the

production of hydrogen peroxide (H

2

O

2

) with PEG-catalase will abolish

PED while blockade of the production of COX metabolites with

indomethacin attenuates the recovery of PED after baroreceptor

activation with either aortic occlusion or antidromical electrical

stimulation of baroreceptor afferents in vivo. Afferent baroreceptor

activity was recorded from the left aortic depressor nerve of

thiopental (40 mg/kg, ip) anesthetized Wistar rats before and after

short periods (10 or 3 minutes) of aortic coarctation or a brief period

of aortic depressor nerve stimulation (5 V, 2 ms, 20 Hz during 10 s).

The protocol with electrical stimulation was performed also in mice.

The central end of the aortic depressor nerve was sectioned

beforehand in both protocols to prevent reflex changes in arterial

pressure. The protocol was carried out before and after the

administration of COX inhibitor indomethacin (5 mg/kg, iv, only in

rats), membrane permeable H

2

O

2

scavenger PEG-catalase (10

4

U/kg,

IV, in rats and mice) or saline (0.1 mL/100 g, iv). There was no

difference in the pattern of response of the ADN activity after the

stimulus with 10 or 3 minutes of aortic coarctation. We observed a

fall in aortic depressor nerve activity to 60±10 % of baseline,

immediately (5 s) after the return of the arterial pressure to normal

values following the coarctation. Baroreceptor activity recovered to

- 86 -

89±8 and 106±3 % of baseline at 30 and 60 s after the stimulus. The

magnitude and time course of PED was not altered after saline

injection. In contrast, PED was significantly prolonged by

indomethacin, averaging 77±6 and 90±5 % of baseline 30 and 60 s

after aortic coarctation. However, PED was abolished by PEG-

catalase, averaging 97±3 and 108±3 % of baseline 5 and 60 s after

aortic coarctation. When indomethacin was administered together

with PEG-catalase the PED was also abolished, averaging 97±4 and

103±3 % of baseline 5 and 60s after aortic coarctation. When

antidromical electrical stimulation was applied we observed a

remarkable fall in aortic depressor nerve activity to 19±2 % of

baseline, immediately (5 s) after aortic depressor nerve stimulation

combined with no change in arterial pressure. Baroreceptor activity

recovered to 69±3 and 92±3 % of baseline at 60 and 120 s after the

stimulus. The magnitude and time course of PED was not altered

after saline injection. In contrast, PED was significantly prolonged by

indomethacin, averaging 43±6 and 49±8 % of baseline 60 and 120 s

after aortic depressor nerve stimulation. However, PED was

remarkably abolished by PEG-catalase, averaging 95±6 and 107±8 %

of baseline 5 and 60s after aortic depressor nerve stimulation. The

administration of indomethacin with PEG-catalase at this protocol

decreased the ADN activity not as much as the control (34±4 % of

baseline 5s after aortic depressor nerve activity) remaining lower

until the end of the experiment (60±7 % of baseline 300s after aortic

depressor nerve activity). In conclusion, the reactive oxygen species

H

2

O

2

yielded during activation of baroreceptor afferents caused PED,

while the blockage endogenous COX metabolites attenuated the

recovery of PED. We speculate that this mechanism may play a role

in rapid baroreceptor resetting during acute hypertension. The

pattern of response of the mouse protocol was similar to rat

response.

- 87 -

8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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- 106 -

10. MANUSCRITO

- 107 -

INFLUENCE OF PROSTACYCLIN AND REACTIVE OXYGEN SPECIES AS

AUTOCRINE REGULATORS OF ARTERIAL BARORECEPTOR ACTIVITY IN VIVO.

Valter J. Santana-Filho

1

; Jaci A. Castania

1

; Helio C. Salgado

1

; Mark W. Chapleau

2

;

Rubens Fazan Jr

1

Department of Physiology

1

, School of Medicine of Ribeirão Preto, University of São

Paulo, Ribeirão Preto, SP and Departments of Internal Medicine and Physiology and

Biophysics

2

, University of Iowa and Veterans Affairs Medical Center, Iowa City, Iowa.

Short Title:

Effects of Prostacyclin and Reactive Oxygen Species in ADN activity.

Correspondence:

Rubens Fazan Jr, PhD.

Department of Physiology,

School of Medicine of Ribeirao Preto - USP,

Av Bandeirante 3900,

Ribeirao Preto, SP, 14049-900, Brazil.

E-mail: [email protected]

Phone: 55 (16) 3602 3331

FAX: 55 (16) 3633 0017

- 108 -

ABSTRACT

Baroreceptor activity is inhibited transiently after brief periods of increased arterial

pressure or electrical stimulation of baroreceptor afferents. This phenomenon is

referred as “post-excitatory depression” (PED). It has been suggested that inhibitory

factors like reactive oxygen species and excitatory factors like cyclooxygenase (COX)

metabolites may be released from baroreceptor endings during its activation and may

modulate the development of PED. In the present study, we tested the hypothesis that

blockade of the production of hydrogen peroxide (H

2

O

2

) with PEG-catalase will abolish

PED while blockade of the production of COX metabolites with indomethacin

attenuates the recover of PED after electrical stimulation of baroreceptor afferents in

vivo. Afferent baroreceptor activity was recorded from the left aortic depressor nerve of

thiopental (40 mg/kg, ip) anesthetized Wistar rats before and after a brief period of

aortic depressor nerve stimulation (5 V, 2 ms, 20 Hz during 10 s). The central end of

the aortic depressor nerve was sectioned beforehand to prevent reflex changes in

arterial pressure. The protocol was carried out before and after the administration of

COX inhibitor indomethacin (5 mg/kg, iv, N=7), membrane permeable H

2

O

2

scavenger

PEG-catalase (10

4

U/kg, IV, N=7) or saline (0.1 mL/100 g, iv, N=6). We observed a

remarkable fall in aortic depressor nerve activity to 19±2 % of baseline, immediately (5

s) after aortic depressor nerve stimulation combined with no change in arterial

pressure. Baroreceptor activity recovered to 69±3 and 92±3 % of baseline at 60 and

120 s after the stimulus. The magnitude and time course of PED was not altered after

saline injection. In contrast, PED was significantly prolonged by indomethacin,

averaging 43±6 and 49±8 % of baseline 60 and 120 s after aortic depressor nerve

stimulation. However, PED was remarkably abolished by PEG-catalase, averaging

95±6 and 107±8 % of baseline 5 and 60s after aortic depressor nerve stimulation. In

conclusion, the reactive oxygen species H

2

O

2

yielded during activation of baroreceptor

afferents caused PED, while endogenous COX metabolites attenuated the recovery of

PED. We speculate that this mechanism may play a role in rapid baroreceptor resetting

during acute hypertension.

Key words: Nerve endings, baroreceptors, baroreceptor reflex, prostacyclin and

autocrine signaling.

- 109 -

INTRODUCTION

Baroreceptors are mechanoreceptors stimulated by the stretch of the vessel

wall leading to reflex regulation of hemodynamic variables such as arterial pressure

and heart rate. Baroreceptor activity increases during a prompt rise in arterial pressure,

but decreases, or resets, as the elevated arterial pressure is maintained [Krieger et al,

1982].

Most of the knowledge of baroreceptor physiology comes from studies in which

baroreceptor activity was recorded from its afferent fibers during changes in arterial

pressure [Krieger et al, 1982; Chapleau et al 1995, Salgado et al, 2006; Do Carmo et

al, 2007], and neural and mechanical viscoelastic mechanisms involved in baroreceptor

activation, or in the resetting to abnormal levels of arterial pressure are difficult to

exam. Davis et al [1998] described an approach in which baroreceptor activity from

aortic depressor nerve of rats was measured in vivo before and after brief periods of

antidromic electrical stimulation of aortic depressor nerve terminals [Davis et al, 1998].

In this approach the aortic depressor nerve was crushed centrally to prevent

stimulation evoked reflex changes in arterial pressure and brief antidromic electrical

stimulation of both myelinated A-fiber and nonmyelinated C-fiber afferents was

performed. As a result of antidromic electrical stimulation a transitory inhibition of

baroreceptor activity was observed, a phenomenon called “post-excitatory depression”

(PED) [Davis et al, 1998]. With this approach, it is possible to evaluate neural

modulators of baroreceptor activity produced locally, without the influence caused by

changes in arterial pressure, once in this preparation there is no change in arterial

pressure levels.

Baroreceptor sensitivity can be modulated

by autocrine/paracrine factors

[Chapleau et al, 1994 and 1995]. Several studies indicate that, particularly,

prostaglandins and prostacyclin

(PGI

2

) activate baroreceptor neurons, as well as

cardiac vagal

afferents [Chen et al, 1990; Xie et al, 1990]. In the isolated carotid sinus

from anesthetized rabbits, cyclooxygenase (COX) inhibitors

attenuated, while PGI

2

enhanced baroreceptor sensitivity to increases

in arterial pressure without changing the

pressure-diameter

relationship; these findings suggest a role for prostanoids

modulating baroreceptor function [Chen et al, 1990]. Although a major source of PGI

2

is

believed to be the vascular endothelium [Spieker et al, 2006], Wang et al [1993] found

that removal of endothelium did not prevent the inhibitory effect

of indomethacin on

baroreceptor activity. It is well known that oxidative stress, defined as an imbalance

between oxidants and antioxidants that favors the former, is a prominent feature of

- 110 -

vascular disease including atherosclerosis, diabetes, and hypertension [Cai and

Harrison, 2000; Harrison et al, 2003]. Opposite to the effect of prostacyclin, reactive

oxygen species (ROS) decreases baroreceptor sensitivity [Chapleau et al, 1995;

Snitsarev et al, 2004]. A study in isolated carotid sinus from anesthetized rabbits

indicates that oxidative stress inhibits baroreceptor activity and that endogenous

oxyradicals produced in the atherosclerotic carotid sinus contributes to baroreceptor

dysfunction [Li et al, 1996]. Moreover, Snitisarev et al [2004 and 2005] showed that

prostacyclin provides an autocrine feedback that restores and enhances the

responsiveness of baroreceptor neurons after their inhibition from excessive neuronal

activation and that hydrogen peroxide (H

2

O

2

) generated in nodose sensory neurons,

during repetitive depolarization, mediates activity-dependent inhibition of action

potential firing. Taken together, the findings of Snitisarev et al [2004 and 2005] and

those from atherosclerotic carotid sinus [Li et al, 1996] provided a rationale for current

study.

Since most of the evidences which demonstrate an influence of COX and ROS

on baroreceptor activity have been obtained from isolated carotid sinus preparations [Li

et al, 1997] or from isolated baroreceptor neurons in culture [Snitisarev et al 2002 and

2005], the aim

of the present study was to investigate in vivo a possible role

of

prostanoids and ROS in modulating aortic baroreceptor activity after antidromic

electrical stimulation. To achieve this, we examined the effect of a COX inhibitor,

indomethacin, and membrane permeable H

2

O

2

scavenger, PEG-Catalase, on aortic

depressor nerve activity before and after its antidromic electrical stimulation.

METHODS

Male Wistar rats (270-340

g) were used in the present study. All procedures

were reviewed

and approved by the Committee of Ethics in Animal Research of the

School of Medicine of Ribeirão

Preto (University of São Paulo), Protocol Number

0028/2006.

The rats were anesthetized with thiopental

sodium (40 mg/kg, i.p; Sigma, St.

Louis, MO, USA). Supplemental doses of anesthetics were administered as needed. A

cervical midline

incision was performed and the trachea was cannulated with

polyethylene

tubing (PE-240 Intramedic,

Clay Adams, Parsippany, NJ, USA) to facilitate

ventilation during spontaneously

breathing. The carotid artery and femoral vein were

catheterized with polyethylene tubing (PE-50, Intramedic,

Clay Adams, Parsippany, NJ,

USA) for arterial pressure recording and

intravenous drug administration, respectively.

- 111 -

Arterial pressure was measured with a pressure transducer

(P23Gb; Statham

Instruments, Hato Hey, Puerto Rico, USA).

Recording of baroreceptor activity from the aortic depressor nerve.

The procedures for recording the whole nerve activity from the

aortic depressor

nerve have been described elsewhere [Salgado et al, 2006].

Using a dissecting

microscope (MC- M2222, D.F. Vasconcelos, São Paulo, SP, Brazil), a 4-6

mm length of

the left aortic depressor nerve was carefully isolated from surrounding connective

tissue, below its junction with the superior laryngeal nerve and placed on a bipolar

stainless steel

electrode with an inter electrode distance of 2 mm. The correct

identification of the nerve was confirmed by its typical pattern

of discharge synchronous

with arterial pulse pressure. Nerve activity

was amplified using a differential high

impedance amplifier (Princeton Applied Research, Oak Ridge, TN, USA) and digitally

sampled (10 kHz), simultaneously, with the carotid pressure, in an IBM/PC equipped

with an analog-to-digital

interface (DI-220, Dataq Inc, Akron, OH, USA).

Stimulation of aortic depressor nerve.

The same electrode that contains the aortic depressor nerve isolated for

recording was connected to a stimulator (AVS-100, AVS Projetos, São Paulo, SP,

Brazil) by means of a key that allowed to switch the electrode from recording to

stimulus. Before the stimulus, the nerve was sectioned at a point rostral to the

electrode. Thus,

the nerve was stimulated with rectangular (5 V, 2 ms, 20 Hz) pulses

delivered during 10s. After the antidromic electrical stimulation the key was

immediately returned to the recording position and the aortic depressor nerve activity

was continuously recorded during 5 min.

Protocol

Afferent aortic depressor nerve activity and arterial pressure were recorded

during 2 min prior to

antidromic electrical stimulation of the aortic depressor nerve. The

effect of the stimulation was evaluated during 5 min. After this first set of stimulus, the

COX inhibitor indomethacin (5 mg/kg, iv, N=7, Sigma, St. Louis, MO, USA), membrane

permeable H

2

O

2

scavenger PEG-Catalase (10

4

U/kg, IV, N=7, Sigma, St. Louis, MO,

USA) or vehicle (saline, 0.1 mL/100g, iv, N=6) was administrated and then proceeded

with new set of stimulus. The differences between the pre-stimulation

baseline levels of

mean arterial pressure and aortic depressor nerve activity measured

over 5 minutes

were quantified before and after drugs administration.

Data Analysis

Data are presented as means ± SE. Aortic depressor nerve activity was

- 112 -

normalized as a percentage of the baseline. Response

data for aortic depressor nerve

stimulation was analyzed by repeated-measures

one-way ANOVA. When ANOVA was

significant, Tukey's multiple

comparison post hoc test was used to assess the

differences between

means. Differences were considered significant when P <

0.05.

RESULTS

Basal level of mean arterial pressure was 147±7 mmHg, 136±4 mmHg and

138±3 mmHg, respectively, in saline, indomethacin and PEG-Catalase treated groups.

Neither, drug administration nor antidromic electrical stimulation changed mean arterial

pressure (Figure 1). Figure 2 shows a typical tracing of a rat illustrating the inhibition

and the recovery of aortic depressor nerve activity elicited by antidromic electrical

stimulation of the nerve. Notice that no change in AP is detected during this maneuver.

Group data corresponding to changes in aortic depressor nerve activity elicited by

antidromic electrical stimulation are presented in Figure 3, before and after

administration of saline (Figure 3, upper panel), indomethacin (Figure 3, middle panel)

or PEG-Catalase (Figure 3, lower panel). In control group (Figure 3, upper panel) it was

observed after antidromic electrical stimulation of the aortic depressor nerve a prompt

fall in nerve activity (Δ= -80% from baseline) which returned to the basal level

approximately 2 minutes after the end of the stimulus. After saline administration

(Figure 3, upper panel) this pattern of response was not changed. Antidromic electrical

stimulation before the administration of indomethacin (Figure 3, middle panel) or PEG-

Catalase (Figure 3, lower panel) provided the same pattern of response as observed in

the control group (Figure 3, upper panel). Even though, indomethacin did not affect the

prompt fall in nerve activity after antidromic electrical stimulation, it did attenuate,

significantly, the recover of aortic depressor nerve activity until the end of the

experiment (Figure 3, middle panel). Figure 4 shows a typical tracing of a rat illustrating

the attenuation of the recovery of aortic depressor nerve activity after antidromic

electrical stimulation of the nerve caused by indomethacin. In contrast, PEG-Catalase

completely blocked the fall in aortic depressor nerve following antidromic electrical

stimulation (Figure 3, lower panel). Figure 5 shows a typical tracing of a rat illustrating

the blockade of aortic depressor nerve activity elicited by antidromic electrical

stimulation of the nerve caused by PEG-Catalase.

DISCUSSION

In the present study, we tested the hypothesis that blockade of the production of

- 113 -

H

2

O

2

with PEG catalase will abolish PED while blockade of the production of COX

metabolites with indomethacin attenuates the recover of PED after electrical stimulation

of baroreceptor afferents in vivo.

The results showed that: (1) antidromic electrical

stimulation of aortic depressor nerve inhibited its activity without change in arterial

pressure; (2) recovery of

aortic depressor nerve activity occurs within 2 minutes after

antidromic electrical stimulation; (3) H

2

O

2

yielded during antidromic electrical

stimulation inhibited aortic depressor nerve activity which was abolished by PEG-

Catalase; (4) indomethacin did not affect the inhibition of aortic depressor nerve activity

after antidromic electrical stimulation, but attenuated its recovery to basal levels.

Previous studies from our laboratory showed that after a brief antidromic

stimulation of the aortic depressor nerve its firing rate was transiently inhibited without

change in arterial pressure [Davies et al, 1998]. It is well established that the primary

mechanism of activation of the baroreceptors is the mechanical deformation caused by

vascular stretching [Chapleau et al, 1995]. However, it is widely know that

neurohumoral factors may have strong effects on baroreceptor endings, modulating

their activity [Chapleau et al, 1991; Li et al, 1997; Salgado et al, 2006]. The release of

chemical substances at the baroreceptor endings may be involved in ionic channel

mechanisms playing a role in aortic depressor nerve activity inhibition after antidromic

electric stimulation (PED) [McDowell et al, 1989; Chapleau et al, 1991]. Nevertheless,

the present study is the first to examine, in vivo, the role of autocrine factors released

at baroreceptor endings involved in the modulation of baroreceptor activity.

ROS consist of several molecules which have extensive and opposite effects on

cellular function [Griendling et al, 2000]. It is well established, already, that ROS plays

a remarkable role in the development of arterial hypertension [Cai and Harrison, 2000;

Redon et al, 2003; Paravicini and Touyz, 2006; Lee et al, 2008]. Patients with arterial

hypertension show increased levels of oxidative stress byproducts associated with

decreased activity of endogenous antioxidant enzymes in blood and mononuclear cells

[Redon et al, 2003]. There are compelling evidences of action of ROS in vascular cells

[Lee and Griendling, 2008; Paravicini and Touyz, 2006]. In the present study the role

played by the ROS, H

2

O

2

, in PED of the aortic depressor nerve was evaluated by

means the administration of PEG-Catalase, an enzymatic scavenger of H

2

O

2

, previous

to antidromic electrical stimulation. We found that PEG-Catalase completely abolished

the transitory inhibition of aortic depressor nerve activity after antidromic electrical

stimulation. This finding indicated that H

2

O

2

was

released from the baroreceptor

endings during the antidromic electrical stimulation and inhibited transiently,

- 114 -

baroreceptor activity. It has been proposed that H

2

O

2

is a potential endothelial-derived

hyperpolarizing factor due to its ability to activate potassium channels in the

vasculature [Sobey et al, 1997; Iida and Katusic, 2000; Matoba et al, 2000]. Calcium-

activated potassium channels can be activated by H

2

O

2

in a number of vascular beds

[Sobey et al, 1997; Iida and Katusic, 2000; Matoba et al, 2000] and it has also been

demonstrated that H

2

O

2

increases Na/K pump activity [Rounds et al, 1998]. The effect

of H

2

O

2

obtained in the current study may be explained by means of an effect on ionic

pumps or channels [Matsuoka et al, 1990; Jabr and Cole, 1995], since it is has been

demonstrated that inhibition in Na/K pump activity with ouabain prevents, or

significantly attenuates, PED after a period of elevated pressure in isolated carotid

sinus preparation [Heesch et al, 1984].

In the present study it was also investigated the role played by autocrine factors

in the recovery of aortic depressor nerve activity after antidromic electrical stimulation.

Because indomethacin did not affect the inhibition of aortic depressor nerve activity

after antidromic electrical stimulation, but attenuated its recovery to basal levels we

concluded that COX metabolites mediate this phenomenon. Even though, a number of

metabolites produced by COX is well known, previous studies in the literature provide

support to the notion that PGI

2

may be the principal factor released by baroreceptor

endings in the process of recovery of its activity after antidromic stimulation. It was

demonstrated in the carotid sinus preparation from renal hypertensive rabbits that the

synthesis of PGI

2

from arachidonic acid was significantly

reduced, and that this

outcome caused a decrease of baroreceptor sensitivity [Xie et al, 1990; Chapleau et al,

1991]. In addition, it is well known that sensory

afferent neurons can be activated by

PGI

2

[Smith et al, 1991; Kwong and Lee, 2002; Harada et al, 2002; Segond et al,

2003; Gu et al, 2003]. There is also evidence that during the stretching of a vessel

caused by an increase in AP besides activating the baroreceptors, it also increases the

release of PGI

2

[Mombuli and Vanhoutte, 1999]. However, it is important to notice that

the release of PGI

2

in the

protocol carried out in the present study seems to occur by

means of a mechanism other than that related to viscoelastic properties of the arterial

wall, because no change in mean arterial pressure was observed during antidromic

electrical stimulation.

It was also found in the present study (data not shown) that PGI

2

does not exert

a tonic influence

on aortic depressor nerve activity because indomethacin by itself

produced no change in basal aortic depressor nerve activity. However, after antidromic

stimulation PGI

2

played a central role in the recovery of aortic depressor nerve activity.

- 115 -

This notion is supported by results obtained from the production

of PGI

2

in nodose

neurons in culture [Snitsarev et al, 2005]. In unstimulated nodose

neurons in culture,

PGI

2

generation is negligible and electrical stimulation of these neurons remarkably

increases PGI

2

, which is

suppressed by indomethacin [Snitsarev et al, 2005].

Therefore, it is hypothesized that the source of generation of PGI

2

after antidromic

electrical stimulation is the baroreceptor endings themselves, in an attempt to restore

its basal activity. It is important to stress that the prolonged suppression of aortic

depressor nerve activity observed after indomethacin is not due to a nonspecific loss of

responsiveness of the nerve because in the protocol when antidromic electrical

stimulation was performed before and after saline administration, the pattern of aortic

depressor nerve activity was not altered.

The results obtained in the present study suggest that H

2

O

2

yielded during

activation of baroreceptor afferents caused PED while PGI

2

, also produced during the

stimulatory maneuver, counteracts this inhibition. Even though the basal levels of local

H

2

O

2

and PGI

2

do not modulate the excitability

of baroreceptors fibers, the amount of

H

2

O

2

released during antidromic electrical stimulation is substantial and may act

throughout ionic and molecular mechanisms decreasing baroreceptor activity. In

addition, the neuronal PGI

2

produced at baroreceptors endings reverses the DPE,

presumably to restore the basal aortic depressor nerve activity.

Overall, the findings observed in the present study, associated with previous

observations in the literature [Xie et al, 1990; Chapleau et al, 1991;

Smith et al, 1991;

Cai and Harrison, 2000; Kwong and Lee, 2002; Harada et al, 2002; Segond et al,

2003; Gu et al, 2003; Redon et al, 2003; Paravicini and Touyz, 2006; Lee et al, 2008]

provide support to the hypothesis that a failure in the

generation of neuronal PGI

2

combined with an increase in the production of H

2

O

2

contributes to the decreased

baroreceptor sensitivity, a hallmark of hypertensive states.

PERSPECTIVES

It is well known that when arterial pressure is changed the baroreceptors reset

rapidly, in terms of seconds or minutes [Undesser et al, 1984], in order to recognize the

prevailing pressure as normal [Kasting et al, 1987; Chapleau et al, 1989; Tan and

Zucker, 1989; Salgado and Machado, 1990]. Our experimental model simulated the

period of transient

elevation of arterial pressure, which leads to a tremendous increase

in the activity of the baroreceptors, leading, over time, to the well known phenomenon

of baroreceptor resetting which, ultimately, represents a decrease in baroreceptor

- 116 -

activity [Krieger et al, 1982]

Our results do indeed show that right after antidromic electrical stimulation,

baroreceptors fibers remarkably decrease their activity. This decreased baroreceptor

activity can be compared, by analogy, to the phenomenon of resetting of baroreceptor

activity to sustained hypertension and might be associated with an increase in H

2

O

2

production. We also report

that endogenous neuronal PGI

2

, produced during antidromic

electrical stimulation, plays an autocrine role

in the recover of baroreceptor activity. The

source of H

2

O

2

responsible for inhibition

of baroreceptor activity cannot be determined

from our data, however this new approach raises the opportunity to use specifics

blockers of H

2

O

2

production, or genetic manipulated animals in the attempt to evaluate

the role played by different sources of ROS in PED. Moreover, these results indicate

that the release of PGI

2

in the aortic depressor nerve endings may have its main

source from neuronal origin because an endothelial source triggered by the shear

stress is no longer activated because no change in mean arterial pressure occurred.

This

notion is supported by data from the literature, showing in carotid sinus

preparation from anaesthetized dogs that the higher pressure thresholds for

baroreceptor activation in the presence of indomethacin

were preserved, even in the

absence of the endothelium [Wang et al, 1993]. In addition, previous studies showed

that indomethacin in the carotid sinus preparation shifts pressure-baroreceptor nerve

activity curve to hypertensive levels [Xie et al, 1990]. Therefore, the preparation used in

the current study allows to evaluate the baroreceptor resetting in a circumstance that

does not involve changes in arterial pressure.

Acknowledgements

This study was supported by grants from FAPESP (Fundação de Amparo à Pesquisa

do Estado de São Paulo, São Paulo, SP, Brazil), CAPES (Coordenadoria de

Aperfeiçoamento do Ensino Superior, Brasília, DF, Brazil) and CNPq (Conselho

Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico, Brasília, DF, Brazil).

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- 122 -

FIGURE LEGENDS

Figure 1: Group data (Mean±SEM) of mean arterial pressure obtained before (C) and

after (5, 10, 30, 60, 120, 180 and 240 seconds) antidromic electrical stimulation of ADN

in saline (upper panel), indomethacin (middle panel) and PEG-Catalase (lower panel)

treated groups.

Figure 2: Typical tracings from a representative animal of control group showing

pulsatile arterial pressure (top) and integrated ADN activity (bottom) before, during and

after 10 s of antidromic electrical stimulation of the left AND (5-V, 2-ms duration, 20Hz).

Figure 3: Group data (Mean±SEM) of integrated activity of ADN before (C) and after

(5, 10, 30, 60, 120, 180 and 240 seconds)antidromic electrical stimulation of ADN in

saline (upper panel), indomethacin (middle panel) and PEG-Catalase (lower panel)

treated groups. * p<0.05 compared with before drug administration.

Figure 4: Typical tracings from a representative animal of indomethacin group showing

pulsatile arterial pressure (top) and integrated ADN activity (bottom) before, during and

after 10 s of antidromic electrical stimulation of the left AND (5-V, 2-ms duration, 20Hz).

Figure 5: Typical tracings from a representative animal of PEG-Catalase group

showing pulsatile arterial pressure (top) and integrated ADN activity (bottom) before,

during and after 10 s of antidromic electrical stimulation of the left AND (5-V, 2-ms

duration, 20Hz).

- 123 -

Figure 1:

MAP

(mmHg)

125

150

175

MAP

(mmHg)

125

150

175

Time after ADN stimulation

0 60 120 180 240

MAP

(mmHg)

125

150

175

Before

After

C

s

- 124 -

Figure 2

50

100

ARTERIAL PRESSURE

(mmHg)

150

0

100

INTEGRATED ADN ACTIVITY

(% basal activity)

200

30 s

Antidromic

ADN Stimulation

50

100

ARTERIAL PRESSURE

(mmHg)

150

0

100

INTEGRATED ADN ACTIVITY

(% basal activity)

200

30 s

Antidromic

ADN Stimulation

- 125 -

Figure 3

Integrated ADN Activity

(% of baseline)

0

25

50

75

100

125

Integrated ADN Activity

(% of baseline)

0

25

50

75

100

125

Time after ADN stimulation

0 60 120 180 240

Integrated ADN Activity

(% of baseline)

0

25

50

75

100

125

Before

After

*

*

*

*

*

*

*

Cs

Figure 4:

- 126 -

30 s

50

100

ARTERIAL PRESSURE

(mmHg)

150

0

100

INTEGRATED ADN ACTIVITY

(% basal activity)

200

Antidromic

ADN Stimulation

30 s

50

100

ARTERIAL PRESSURE

(mmHg)

150

0

100

INTEGRATED ADN ACTIVITY

(% basal activity)

200

Antidromic

ADN Stimulation

- 127 -

Figure 5:

2D G raph 1

50

100

ARTERIAL PRESSURE

(mmHg)

150

0

100

INTEGRATED ADN ACTIVITY

(% basal activity)

200

30 s

Antidromic

ADN Stimulation

2D G raph 1

50

100

ARTERIAL PRESSURE

(mmHg)

150

0

100

INTEGRATED ADN ACTIVITY

(% basal activity)

200

30 s

Antidromic

ADN Stimulation

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