( PDF ) Dengue: caracterização de marcadores moleculares de virulência utilizando a tecnologia de genomas infecciosos

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UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARANÁ

INSTITUTO DE BIOLOGIA MOLECULAR DO PARANÁ

INSTITUTO CARLOS CHAGAS – FIOCRUZ/PR

DENGUE: CARACTERIZAÇÃO DE MARCADORES MOLECULARES DE

VIRULÊNCIA UTILIZANDO A TECNOLOGIA DE GENOMAS INFECCIOSOS

LUANA DE BORBA

CURITIBA

MARÇO 2010

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LUANA DE BORBA

DENGUE: CARACTERIZAÇÃO DE MARCADORES MOLECULARES DE

VIRULÊNCIA UTILIZANDO A TECNOLOGIA DE GENOMAS INFECCIOSOS

Tese apresentada ao Curso de Pós-

Graduação em Biologia Celular e Molecular,

Área de Concentração em Biologia Molecular,

Departamento de Biologia Celular e

Molecular, Setor de Ciências Biológicas,

Universidade Federal do Paraná, como parte

das exigências para obtenção do título de

Doutor em Biologia Celular e Molecular.

Orientadora: Dra. Claudia N. Duarte dos

Santos

CURITIBA

2010

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Aos meus pais, Itané e Vanize, e ao meu irmão,

Henrique, por toda dedicação, confiança,

paciência, compreensão, e que nunca mediram

esforços para me ajudar a chegar até aqui.

AGRADECIMENTOS

Agradeço imensamente aos meus pais, Itané de Borba e Vanize R. M. de

Borba, que, com carinho, amor e paciência, me ensinaram a trilhar os caminhos em

busca de meus ideais e sonhos. A todos os meus familiares e amigos que sempre

me apoiaram e torceram pelo meu sucesso. E ao Carlos A. Palacios, por me

incentivar, apoiar e tranquilizar perante os obstáculos, independente da distância

física que nos separa.

À Dra. Claudia N. Duarte dos Santos, agradeço pelos muitos anos de

confiança em meu trabalho, sempre disponibilizando o espaço e oportunidade para

meu desenvolvimento profissional.

Aos diretores e fundadores do Instituto Carlos Chagas, Dr. Samuel

Goldenberg, Dr. Marco Aurélio Krieger, Dr. Stênio P. Fragoso e Dra. Claudia N.

Duarte dos Santos, agradeço pela confiança e oportunidade de fazer parte da

equipe, disponibilizando recursos e um ambiente de alta tecnologia, fazendo com

que nosso trabalho seja cada vez melhor.

Agradeço ao Dr. Peter W. Mason, que com paciência e dedicação, me

ensinou toda a base da tecnologia utilizada neste trabalho. Sem este conhecimento,

o trabalho não seria possível.

A todos os amigos e colegas que fazem ou fizeram parte do laboratório de

Virologia Molecular do ICC: Ana Luiza P. Mosimann, Andrea C. Koishi, Aurélio S.

Zeferino, Camilla N. da Costa, Daisy M. Strottmann, Eleonora Campos, Federico

Hoffmann, Florencia Meyer, Giovanny C. A. Mazzarotto, Guilherme F. Silveira,

Juliano Bordignon, Lorena C. Pena, Marina R. T de Araujo, Mário H. Queiroz, Meg C.

C. Costa, Meri B. Nogueira, Paula R. Zanello, Sonia M. Raboni, Suzana Carstensen

e Vanessa Stella, muito obrigada por todo apoio, crítica e companheirismo ao longo

de todos estes anos. Em especial à Ana, Daisy, Marina, Suzana e Vanessa que

sempre estiveram dispostas a auxiliar em meus experimentos práticos na minha

ausência do laboratório, à Ana pela paciência, sugestões e revisão da escrita, e ao

Giovanny por todo apoio e colaboração nos experimentos animais.

À Dra. Lucia Noronha e às técnicas, Ana Paula Martins e Marina Luise Viola

de Azevedo, do Laboratório de Patologia Clínica da PUC/PR, agradeço pela

colaboração, execução das lâminas histológicas e orientação nas análises de

histopatologia por microscopia óptica.

Agradeço a todo pessoal do preparo, Nilson J. Fidencio, Vanessa M. dos

Santos, Tânia R. Schepainski, Rafael C. Brito e Janaina S. da Silva, pela dedicação

e preparo cuidadoso dos materiais e reagentes indispensáveis para realização de

nossos trabalhos. Aos funcionários da manutenção, Leszek Gadja e Frederico

Torres Martins, por estarem sempre dispostos a realizar pequenos detalhes que

fazem diferença. Ao Paulo R. C. Arauco por todo auxílio na utilização do

sequenciador automático, e a todos da secretaria do ICC, Luiz C. Casarotto, Edilaine

Azevedo, Maria Cristina P. Barreto e Marcele T. N. Stimamiglio, e da secretaria da

UFPR, Marlene B. de Camargo, pela ajuda em todas as questões burocráticas

necessárias, facilitando nossa jornada.

Agradeço a todos os demais colegas e amigos do ICC aqui não mencionados,

pelo companheirismo, sempre dando uma ajudinha aqui e outra ali.

Aos membros da banca, Dr. Peter W, Mason, Dra. Myrna C. Bonaldo, Dr.

Stênio P. Fragoso e Dr. Bruno D. Muniz, e suplentes, Dr. Juliano Bordignon e Dra.

Andrea A. Ávila, por aceitarem o convite de participar desta banca.

Ao TECPAR, agradeço por conceder o espaço do biotério, sem o qual este

trabalho não seria possível. Aos órgãos de fomento, Fundação Araucária, PROSUL,

FIOCRUZ e CNPq pelo apoio financeiro, e à CAPES pela concessão da bolsa.

Luana de Borba

A mente que se abre a uma nova idéia jamais voltará ao seu tamanho original.

Albert Einstein

Somente aqueles que arriscam ir um pouco mais longe,

sabem até onde podem chegar!

RESUMO

A dengue é hoje a principal arbovirose tropical, em termos de morbidade e

mortalidade, e é transmitida ao homem através da picada de mosquitos do gênero Aedes. O

vírus da dengue pertence à família Flaviviridae, gênero Flavivírus e possui 4 sorotipos

(DENV1-4), e até o momento não existe uma vacina disponível ou tratamento especifico

para a dengue. A infecção por qualquer um dos sorotipos pode causar desde quadros

assintomáticos, febre clássica da dengue, ou ainda casos graves da doença, com eventos

hemorrágicos, e eventualmente óbito. Dados recentes têm demonstrado que o perfil das

manifestações clínicas da doença tem modificado nos últimos anos, e o aparecimento de

episódios de encefalite associados à infecção pelo DENV tem aumentado

significativamente. Com o intuito de estudar a neuropatologia associada à infecção por

DENV, Desprès et al. (1998) e Bordignon et al. (2007), utilizando modelo murino, geraram

variantes de DENV1 altamente neurovirulentas, que se replicam eficientemente no SNC de

camundongos. Os determinantes genéticos potencialmente responsáveis pelo fenótipo

neurovirulento dessas variantes virais mapeiam nas proteínas E (E402 e E405) e NS3 (NS3-

209, NS3-435 e NS3-480). Para confirmar o envolvimento dessas mutações e visando

compreender alguns aspectos dos mecanismos moleculares envolvidos na

neuropatogênese da dengue, foram gerados clones infecciosos recombinantes contendo

cada uma das mutações isoladamente ou em conjunto. Os vírus gerados a partir desses

clones foram avaliados quanto ao seu potencial de replicação em células de inseto,

infectividade no SNC de camundongos Swiss neonatos, modulação de resposta imune e

análises histopatológicas do tecido cerebral de animais infectados. Foi observado que os

vírus contendo as mutações NS3-435, NS3-480, E405/NS3-435 ou E402/NS3-480 eram

capazes de provocar sintomas similares aos das cepas neurovirulentas em camundongos,

como sinais de encefalite e paralisia parcial dos membros inferiores. Os grupos de animais

infectados com os outros vírus recombinantes exibiram comportamento normal, sugerindo

que as mutações NS3-435 e NS3-480 desempenhem um papel importante na

neuropatogênese da dengue em camundongos. A replicação viral no SNC, avaliada por

qPCR, foi maior nos animais inoculados com os vírus E405/NS3-435 e E402/NS3-480, que

tiveram altas taxas de mortalidade. Além disso, os mesmos grupos de animais

apresentaram uma maior modulação na transcrição de genes relacionados à resposta imune

inata. Esse conjunto de dados indica que esses vírus são capazes de se replicarem de

forma eficiente no SNC dos animais, desencadeando uma resposta imune exacerbada que

está provavelmente envolvida na imunopatogênese da dengue. As análises histológicas das

amostras de tecido cerebral dos animais evidenciaram a presença de infiltrado mononuclear

em vasos, necrose neuronal, nódulo microglial, além de meningite, moderada a aguda, em

todas as amostras, sendo os danos de maior extensão nos animais inoculados com os vírus

E405/NS3-435 e E402/NS3-480. Os resultados gerados neste trabalho indicaram que vírus

recombinantes contendo mutações pontuais no domínio helicase da proteína NS3

apresentaram maior habilidade de replicação e produção de partículas virais infectivas no

SNC murino, causando encefalite e altas taxas de mortalidade. A geração de vírus contendo

a dupla de mutações nas proteínas helicase e E, parece potencializar este efeito

aumentando o dano no SNC, a resposta imune e a taxa de mortalidade dos animais.

Atualmente estamos avaliando o comportamento biológico de novos vírus recombinantes

exibindo diferentes aminoácidos na posição NS3-480 e estudando a interação da NS3hel

com fatores virais e celulares, visando desvendar alguns aspectos relacionados à

neuropatogênese da dengue.

Palavras-chave: Vírus da dengue sorotipo 1. Clone infeccioso. Modelo murino.

Neurovirulência. Marcadores moleculares de virulência. Proteína E. Proteína NS3.

ABSTRACT

Nowadays, dengue is the main tropical arbovirus in terms of morbidity and mortality

and is transmitted to humans by the bite of mosquitoes of the genus Aedes. The dengue

virus belongs to the family Flaviviridae, genus Flavivirus, and has 4 characterized serotypes

(DENV1-4), and so far there is no vaccine available. The infection by any of the serotypes

can cause asymptomatic cases, classical dengue fever, or severe cases of the disease,

hemorrhagic events, and eventually death. Recent data have shown that the profile of the

clinical manifestations of the disease has changed in recent years and the number of

episodes of encephalitis associated with DENV infection has increased significantly. In order

to study the neuropathology associated with infection by DENV, Després et al. (1998) and

Bordignon et al. (2007), using a mouse model, generated DENV1 variants highly

neurovirulent, which replicate efficiently in the CNS of mice. The genetic determinants

potentially responsible for the neurovirulent phenotype of these variants map in the E protein

(E402 and E405) and NS3 (NS3-209, NS3-435 and NS3-480). To confirm the involvement of

these mutations and trying to understand some aspects of the molecular mechanisms

involved in the neuropathogenesis of dengue, infectious recombinant clones were generated

containing each mutation alone or in combination. Viruses generated from these clones were

assessed for their potential of replication in insect cells, infectivity in the CNS of newborn

Swiss mice, modulation of immune response and pathological examinations of brain tissue

from infected animals. It was observed that viruses containing mutations NS3-435, NS3-480,

E405/NS3-435 or E402/NS3-480 were able to cause similar symptoms to the neurovirulent

strains in mice, as signs of encephalitis and partial paralysis of limbs. The groups of animals

infected with other recombinant viruses exhibited normal behavior, suggesting that mutations

NS3-435 and NS3-480 play an important role in the neuropathogenesis of dengue in mice.

Viral replication in the CNS, evaluated by qPCR, was higher in animals inoculated with the

virus E405/NS3-435 and E402/NS3-480, which had high mortality rates. Moreover, the same

groups of animals showed a greater modulation in the transcription of genes related to innate

immune response. This set of data indicates that these viruses are able to replicate efficiently

in the CNS of animals, triggering an exacerbated immune response that is probably involved

in the immunopathogenesis of dengue. Histological analysis of samples of brain tissue of

animals showed the presence of mononuclear cells in blood vessels, neuronal necrosis,

microglial nodules, and meningitis, moderate to acute, in all the samples, and the larger

damage was observed in the animals inoculated with the virus E405/NS3-435 and

E402/NS3-480. The results generated in this study indicated that recombinant viruses

containing mutations in the helicase domain of NS3 protein showed higher ability of

replication and production of infective viral particles in the murine CNS, causing encephalitis

and high mortality rates. The generation of viruses containing double mutations in helicase

proteins and E, appears to enhance this effect by increasing the damage in the CNS, the

immune response and the mortality rate of animals. We are currently evaluating the

biological performance of new recombinant viruses exhibiting different amino acid at position

NS3-480 and examining the interaction of NS3hel with viral and cellular factors, in order to

uncover some aspects related to the neuropathogenesis of dengue.

Keywords: Dengue virus serotype 1. Infectious clone. Murine model. Neurovirulence.

Molecular markers of virulence. E protein. NS3 protein.

LISTA DE ILUSTRAÇÕES

Figura 1.1 –

Distribuição mundial das áreas de risco de dengue (laranja) em

2009...............................................................................................

Figura 1.2 –

Reinfestação com mosquito Aedes aegypti na América Latina e

Caribe............................................................................................

Figura 1.3 –

Número de casos de dengue no Brasil de 1986 a 2009...............

Figura 1.4 –

Representação de partículas de Flavivirus imaturas.....................

Figura 1.5 –

Representação esquemática da organização do genoma do

vírus da dengue e clivagem da poliproteína em três proteínas

estruturais e sete não-estruturais por proteases viral e do

hospedeiro.....................................................................................

Figura 1.6 –

Representação de uma porção das sequências e predição das

estruturas secundárias das regiões 5’NTR e 3’NTR, indicando

seus elementos.............................................................................

Figura 1.7 –

Representação esquemática da vista lateral de um homodímero

da proteína E e seus elementos....................................................

Figura 1.8 –

Representação esquemática do genoma e estrutura tri-

dimensional do domínio helicase da proteína NS3 de JEV...........

Figura 1.9 –

Representação gráfica do mecanismo de fusão mediado por

proteínas virais de fusão da classe II……………………………….

Figura 1.10 –

Esquema da morfogênese do vírus da dengue……………………

Figura 1.11 –

Esquema da neuroadaptação da cepa FGA/89 em modelo

murino............................................................................................

Figura 3.1 –

Representação esquemática das etapas da amplificação dos

fragmentos contendo as mutações de interesse (fragm A, fragm

B e fragm fusão) e as respectivas enzimas de restrição

utilizadas para cada estratégia de clonagem................................

Figura 3.2 –

Mapa do plasmídeo pGEM-T Easy (Promega).............................

Figura 3.3 –

Representação esquemática do mapa do genoma infeccioso

pBACDV1......................................................................................

Figura 3.4 –

Representação esquemática da digestão dos clones pBACDV1

e E402pGEM ou E405pGEM (Emut-pGEM) com as enzimas de

restrição NotI e MluI......................................................................

Figura 3.5 –

Representação esquemática da digestão do clone pBACDV1 e

do fragmento de PCR NS3-209 com as enzimas de restrição

MluI e BsiWI..................................................................................

Figura 3.6 –

Representação esquemática da digestão dos clones pBACDV1

e NS3-435-pGEM com as enzimas de restrição BsiWI e

RsrII...............................................................................................

Figura 3.7 –

Representação esquemática da digestão do clone pBACDV1 e

do fragmento de PCR NS3-480 com as enzimas de restrição

BsiWI e NheI..................................................................................

Figura 3.8 –

Representação esquemática da digestão do clone pBACDV1

com enzimas de restrição SwaI.....................................................

Figura 4.1 –

Localização das mutações da proteína de Envelope....................

Figura 4.2 –

Localização das mutações na proteína NS3.................................

Figura 4.3 –

Eletroforese em gel de agarose 0,8% das amplificações dos

fragmentos mutados......................................................................

Figura 4.4 –

Eletroforese em gel de agarose 0,8% das minipreparações em

pGEM-T Easy dos clones confirmados por sequenciamento.......

Figura 4.5 –

Eletroforese em gel de agarose 0,8% das digestões dos

fragmentos contendo as mutações para cada estratégia..............

Figura 4.6 –

Eletroforese em gel de agarose 0,8% das minipreps e PCRs das

minipreps dos clones E402pBAC..................................................

Figura 4.7–

Representação esquemática do perfil da digestão BstBI

confirmatória dos PCRs de colônia dos clones E405pBAC..........

Figura 4.8 –

Eletroforese em gel de agarose 0,8% da digestão confirmatória

dos PCRs de colônia dos clones E405pBAC................................

Figura 4.9 –

Eletroforese em gel de agarose 0,8% das minipreps e PCRs das

minipreps dos clones E405pBAC..................................................

Figura 4.10 –

Representação esquemática do perfil da digestão EcoRV

confirmatória dos PCRs de colônia dos clones NS3-209pBAC....

100

Figura 4.11 –

Eletroforese em gel de agarose 0,8% da digestão confirmatória

dos PCRs de colônia dos clones NS3-209pBAC..........................

100

Figura 4.12 –

Eletroforese em gel de agarose 0,8% das minipreps e PCRs a

partir das minipreps dos clones NS3-209pBAC............................

101

Figura 4.13 –

Eletroforese em gel de agarose 0,8% das minipreps e PCRs das

minipreps dos clones NS3-435pBAC............................................

102

Figura 4.14 –

Representação esquemática do perfil da digestão BsaBI

confirmatória dos PCRs de colônia dos clones NS3-480pBAC....

102

Figura 4.15 –

Eletroforese em gel de agarose 0,8% da digestão confirmatória

dos PCRs de colônia dos clones NS3-480pBAC..........................

103

Figura 4.16 –

Eletroforese em gel de agarose 0,8% das minipreps e PCRs das

minipreps dos clones NS3-480pBAC............................................

104

Figura 4.17 –

Esquema das estratégias dos clones duplo e triplo mutantes

pela substituição de fragmentos. Nos clones E405/NS3-435,

E402/NS3-209 e E402/NS480, as cores representam o

backbone e fragmentos utilizado para a clonagem da segunda

mutação. As estrelas pretas representam a localização de cada

mutação.........................................................................................

105

Figura 4.18 –

Eletroforese em gel de agarose 0,8% das digestões dos

fragmentos contendo as mutações para estratégias dos duplos

mutantes........................................................................................

105

Figura 4.19 –

Eletroforese em gel de agarose 0,8% da amplificação dos PCRs

de colônia dos clones E405/NS3-435...........................................

106

Figura 4.20 –

Eletroforese em gel de agarose 0,8% da amplificação e

digestão confirmatória dos PCRs de colônia dos clones

E402/NS3-209...............................................................................

107

Figura 4.21 –

Eletroforese em gel de agarose 0,8% da amplificação e

digestão confirmatória dos PCRs de colônia dos clones

E402/NS3-480...............................................................................

108

Figura 4.22 –

Eletroforese em gel de agarose 0,8% das minipreps dos clones

duplo mutantes..............................................................................

108

Figura 4.23 –

Eletroforese em gel de agarose 0,8% da amplificação dos PCRs

das minipreps E402/NS3-209 (10, 13 e 17) e E402/NS3-480

(89, 90 e 91)..................................................................................

109

Figura 4.24 –

Eletroforese em gel de agarose 0,8% da amplificação e

digestão confirmatória dos PCRs de colônia dos clones

E402/NS3-209/NS3-480................................................................

110

Figura 4.25 –

Eletroforese em gel de agarose 0,8% dos clones triplo

mutantes........................................................................................

111

Figura 4.26 –

Eletroforese em gel de agarose 0,8% das minipreps de cada

clone confirmado por sequenciamento..........................................

112

Figura 4.27 –

Eletroforese em gel de agarose 0,8% das digestões SwaI das

minipreps de cada clone confirmado por sequenciamento...........

113

Figura 4.28 –

Eletroforese em gel de agarose 0,8% dos RNAs resultantes das

transcrições in vitro de cada clone................................................

114

Figura 4.29 –

Representação gráfica dos títulos virais obtidos nas diferentes

metodologias de transfecção em células de inseto (em azul) e

mamífero (em vermelho)...............................................................

115

Figura 4.30 –

Representação gráfica dos títulos virais obtidos na transfecção

dos clones recombinantes em cultura de células de inseto..........

116

Figura 4.31 –

Representação gráfica dos títulos virais obtidos nas passagens

1 e 2 dos vírus gerados a partir dos clones recombinantes, em

cultura de células de inseto...........................................................

117

Figura 4.32 –

Eletroforeses em gel de agarose 0,8% das amplificações por

PCR dos genomas completos dos vírus recombinantes...............

120

Figura 4.33A –

Alinhamento de aminoácidos das amostras pBACDV1,

E402pBAC_cl.12.2, E405pBAC_cl.9.13, NS3-209pBAC_cl.85,

NS3-435pBAC_cl.11.4, NS3-480pBAC_cl.9, E402/NS3-

209_cl.17, E402/NS3-480_cl.89, E405/NS3-435_cl.3 e

E402/NS3-209/NS3-480_cl.27......................................................

121

Figura 4.33B –

Alinhamento de aminoácidos das amostras pBACDV1,

E402pBAC_cl.12.2, E405pBAC_cl.9.13, NS3-209pBAC_cl.85,

NS3-435pBAC_cl.11.4, NS3-480pBAC_cl.9, E402/NS3-

209_cl.17, E402/NS3-480_cl.89, E405/NS3-435_cl.3 e

E402/NS3-209/NS3-480_cl.27, destacando as regiões de

localização das mutações estudadas............................................

122

Figura 4.34 –

Efeito citopático produzido pelos vírus recombinantes em cultura

de células de inseto C6/36 nos tempos de 5, 6 e 7 dias pós-

infecção.........................................................................................

124

Figura 4.35 –

Análise comparativa da reação de imunofluorescência dos vírus

recombinantes em cultura de células de inseto C6/36 com 5

dias pós-infecção...........................................................................

126

Figura 4.36 –

Representação gráfica da sobrevivência dos animais inoculados

i.c. com pBACDV1, no ensaio de DL

..........................................

128

Figura 4.37 –

Representação gráfica da sobrevivência dos animais inoculados

com os vírus recombinantes e controles ao longo de 21 dias.......

130

Figura 4.38 –

Resultado da amplificação por qPCR para TMEV nas amostras

dos vírus recombinantes e das cepas neuroadaptadas FGA/NA-

P6 e FGA/NA-d1d..........................................................................

131

Figura 4.39 –

Representação gráfica da amplificação do RNA viral por qPCR

dos vírus recombinantes e das cepas neuroadaptadas FGA/NA-

P6 e FGA/NA-d1d..........................................................................

132

Figura 4.40 –

Quantificação da modulação de genes diferencialmente

expressos durante a infecção do SNC de camundongos com os

vírus recombinantes gerados neste trabalho................................

134

Figura 4.41 –

Ilustração das regiões do cérebro e local de inoculação dos

vírus...............................................................................................

135

Figura 4.42 –

Histopatologia do córtex fronto-parietal do SNC de

camundongos, destacando os critérios que caracterizam o

quadro de encefalite, lâminas coradas com hematoxilina-eosina.

137

Figura 4.43 –

Histopatologia do SNC de camundongos inoculados com vírus

recombinantes, áreas da meninge, córtex frontal e córtex

temporal………………………………………………………………...

138

Figura 4.44 –

Análises por imunohistologia do SNC de camundongos

inoculados com vírus recombinantes............................................

140

Figura 4.45 –

Eletroforese em gel de agarose 0,8% das amplificações dos

novos fragmentos mutados NS3-480............................................

143

Figura 4.46 –

Eletroforese em gel de agarose 0,8% das amplificações por

PCR de fusão dos novos fragmentos mutados NS3-480..............

143

Figura 4.47 –

Eletroforese em gel de agarose 0,8% das digestões BsiWI/NheI

dos fragmentos contendo as novas mutações NS3-480...............

144

Figura 4.48 –

Eletroforese em gel de agarose 0,8% da digestão confirmatória

dos PCRs de colônia dos novos clones NS3-480 com

endonuclease de restrição BsaBI..................................................

145

Figura 4.49 –

Estrutura química dos aminoácidos escolhidos para clonagem

na posição NS3-480......................................................................

146

Figura 4.50 –

Eletroforeses em gel de agarose 0.8% dos novos clones NS3-

480.................................................................................................

147

LISTA DE QUADROS

Quadro 1.1 –

Substituições de aminoácidos identificadas nos genomas dos

vírus neuroadaptados FGA/NA-d1d e FGA/NA-P6, em

comparação com a cepa parental FGA/89 e o genoma do clone

infeccioso pBACDV1....................................................................

Quadro 3.1 –

Oligonucleotídeos iniciadores utilizados para amplificação dos

fragmentos contendo as mutações de interesse para

clonagem......................................................................................

Quadro 3.2 –

Oligonucleotídeos iniciadores utilizados para sequenciamento

dos possíveis clones recombinantes clonados em pGEM-T

Easy.............................................................................................

Quadro 3.3 –

Oligonucleotídeos iniciadores utilizados para amplificação por

PCR de colônia e enzimas de restrição utilizadas para digestão

dos PCRs, para confirmação de clones.......................................

Quadro 3.4 –

Oligonucleotídeos iniciadores utilizados para amplificação de

PCR dos possíveis clones recombinantes clonados em pBAC...

Quadro 3.5 –

Oligonucleotídeos iniciadores utilizados para sequenciamento

dos PCR dos possíveis clones recombinantes clonados em

pBAC............................................................................................

Quadro 3.6 –

Oligonucleotídeos iniciadores utilizados para amplificação dos

PCR dos possíveis clones, duplos e triplo mutante, para

confirmação por sequenciamento................................................

Quadro 3.7 –

Oligonucleotídeos iniciadores utilizados para amplificação por

PCR do genoma completo dos clones a partir do RNA dos vírus

purificados por gradiente de sacarose.........................................

Quadro 3.8 –

Oligonucleotídeos iniciadores utilizados para sequenciamento

do genoma completo dos clones a partir das amplificações por

PCRs dos vírus purificados em gradiente de sacarose...............

Quadro 3.9 –

Oligonucleotídeos iniciadores utilizados para reações de

amplificação por qPCR.................................................................

Quadro 3.10 –

Identificação dos genes e vias escolhidas para o estudo do

perfil da expressão gênica no tecido cerebral de camundongos

infectados com os vírus recombinantes e controles....................

Quadro 3.11 –

Oligonucleotídeos iniciadores utilizados nas reações de

amplificação por qPCR para o estudo do perfil da expressão

gênica no tecido cerebral de camundongos infectados com os

vírus recombinantes e controles..................................................

Quadro 3.12 –

Novos aminoácidos selecionados para clonagem na posição

NS3-480, para avaliação da importância da característica do

aminoácido no processo de neurovirulência. Identificado em

azul, o aminoácido do vírus parental não virulento FGA/89, e

em vermelho, o aminoácido na cepa neurovirulenta FGA/NA-

P6.….............................................................................................

Quadro 3.13 –

Oligonucleotídeos iniciadores utilizados para amplificação dos

fragmentos NS3-480....................................................................

Quadro 4.1 –

Resumo da identificação dos clones gerados..............................

111

Quadro 4.2 –

Classificação da lesão observada no tecido cerebral dos

camundongos infectados com os diferentes vírus, de acordo

com o grau de comprometimento.................................................

136

Quadro 4.3 –

Compilação resumida dos resultados obtidos com os clones

construídos neste trabalho, com o respectivo esquema da

localização de cada mutação.......................................................

142

LISTA DE ABREVIATURAS, SIGLAS E SÍMBOLOS

– por cento

– infinito

– alfa

4G2

– anticorpo monoclonal anti-Envelope, Flavivirus-específico

– angstrom

– aminoácidos

ADE

– fenômeno dos anticorpos potencializadores da infecção (antibody

dependent-enhancement)

Ala

– aminoácido alanina

AP61

– linhagem celular de mosquito Aedes pseudocutellaris

Arg

– aminoácido arginina

Asn

– aminoácido asparagina

AVE

– tampão de eluição de extração de RNA

– beta

BAC

– cromossomo artificial de bactéria (bacterial artificial chromosome)

BCIP

– 5-Bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate

BeAn

– cepa de baixa virulência do vírus da encefalomielite murina de

Theiler

BHK-21

– linhagem celular de mamífero – baby hamster kidney

BR/90

– cepa de vírus da dengue sorotipo 1

C6/36

– linhagem celular de glândula salivar de mosquito Aedes albopictus

C1r

– gene complement component 1, subcomponent r

C3a

– elemento do sistema complemento

C5a

– elemento do sistema complemento

– proteína de capsídeo do vírus da dengue

CaCl

– cloreto de cálcio

Ccl5

– gene ligante de quimiocina 5

CCR5

– receptor do gene Ccl5

cDNA

– DNA complementar

CEP/UFPR

– Conselho de ética em pesquisa da Universidade Federal do

Paraná

cl.

– clone

CMC

– carboxi metil celulose

CNS

– sistema nervoso central (central nervous system)

– gás carbônico

CPE

– efeito citopático

– complexo de replicação viral

cryoEM

– crio-microscopia eletrônica

CSs

– regiões de sequências conservadas (conserved sequences)

C-terminal

– porção carboxi-terminal

– cepa de baixa virulência do vírus da encefalomielite murina de

Theiler

DAB

– 3,3' - diaminobenzidina

DCC

– dengue com complicação

DC-SIGN

– receptor celular (dendritic-cell-specific ICAM-grabbing non-integrin)

DEAH

– sequência de aminoácidos do motivo II das RNA helicases,

aspartato-glutamato-alanina-histidina

DENV1

– vírus da dengue sorotipo 1

DENV2

– vírus da dengue sorotipo 2

DENV3

– vírus da dengue sorotipo 3

DENV4

– vírus da dengue sorotipo 4

– febre da dengue (dengue fever)

DHF

– febre hemorrágica da dengue (dengue hemorrhagic fever)

DL50

– 50% da dose letal

DNA

– ácido desoxirribonucléico

dpi

– dias pós inoculação ou infecção

Dra

– doutora

DSS

– síndrome do choque da dengue (dengue shock syndrome)

– aminoácido ácido glutâmico

– proteína de envelope do vírus da dengue

E402pBAC

– clone infeccioso de dengue 1 pBACDV1 contendo a mutação na

posição 402 da proteína de envelope

E402/NS3-209

– clone infeccioso de dengue 1 pBACDV1 contendo as mutações

nas posições 402 da proteína de envelope e 209 da proteína NS3

E402/NS3-480

– clone infeccioso de dengue 1 pBACDV1 contendo as mutações

nas posições 402 da proteína de envelope e 480 da proteína NS3

E405pBAC

– clone infeccioso de dengue 1 pBACDV1 contendo a mutação na

posição 405 da proteína de envelope

E405/NS3-435

– clone infeccioso de dengue 1 pBACDV1 contendo as mutações

nas posições 405 da proteína de envelope e 435 da proteína NS3

– tampão de eluição (elution buffer)

EDTA

– Diaminoethane-tetraacetic acid

– aminoácido fenilalanina

– cepa neurovirulenta do vírus da encefalomielite murina de Theiler

ffu

– unidade formadora de foco (focus forming unit)

ffu/mL

– unidade formadora de foco por mililitro de cultura

FGA/NA-d1d

– cepa neurovirulenta do vírus da dengue sorotipo 1

FGA/NA-P6

– cepa neurovirulenta do vírus da dengue sorotipo 1

FGA/89

– cepa de vírus da dengue tipo 1

fragm

– fragmento

– grama

– aminoácido glicina

GBS

– síndrome de Guillain-Barré

GDVII

– cepa neurovirulenta do vírus da encefalomielite murina de Theiler

GenBank

– base de dados de sequências de livre acesso produzida pelo

National Center for Biotechnology Information (NCBI)

Gln

– aminoácido glutamina

Glu

– aminoácido ácido glutâmico

Gly

– aminoácido glicina

GRP78/BiP

– receptor celular

GSGKT

– sequência de aminoácidos do motivo I das RNA helicases, glicina-

serina-glicina-lisina-treonina

– aminoácido histidina

– horas

H1 ou H1

pred

– estrutura em "-hélice da haste de proteína de envelope

H2 ou H2

pred

– estrutura em "-hélice da haste de proteína de envelope

– água

HCl

– ácido clorídrico

HCV

– vírus da hepatite C

HDV-RZ

– ribozima do vírus da hepatite delta

His

– aminoácido histidina

HSP70

– receptor celular (heat shock protein 70)

HSP90

– receptor celular (heat shock protein 90)

HSV-2

– vírus Herpes Simples-2

i.c.

– intracerebral

IFN

– interferon

IgM

– imunoglobulina do tipo M

Ile

– aminoácido isoleucina

i.p.

– intraperitoneal

IPTG

– Isopropyl !-D-1-thiogalactopyranoside

Irf1

– gene interferon regulatory factor 1

ISG

– genes estimulados por interferon

ISG15

– proteína tipo-ubiquitina

JAK1

– quinase do tipo Janus (Janus kinase 1)

JEV

– vírus da encefalite japonesa

– quilobase

KCl

– cloreto de potássio

kDa

– quilodaltons

– fosfato de potássio monobásico

KUNV

– vírus Kunjin

– aminoácido leucina

L15

– meio de cultivo de células de inseto C6/36 – Leibovitz L-15 (Gibco)

– meio de cultivo de bactérias Luria Broth

Leu

– aminoácido leucina

LGTV

– vírus Langat

L-SIGN

– receptor celular

Lys

– aminoácido lisina

– micro

– microfaraday

!g/mL

– microgramas por mililitro

– microlitro

– micromolar

– molar

– magnésio

MgCl

– cloreto de magnésio

mg/mL

– miligramas por mililitro

MHC

– complexo de histocompatibilidade (major histocompatibility

complex)

MHV

– vírus da hepatite murina

min.

– minutos

– mililitro

– milimolar

Met

– aminoácido metionina

mock

– controle negativo de infecção

MOI

– multiplicidade de infecção (multiplicity of infection)

mRNA

– RNA mensageiro

MTase

– metiltransferase

murGAPDH

– gene de expressão constitutiva gliceraldeído-3-fosfato

desidrogenase de Mus musculus

MVE

– Encefalite de Murray Valley

– nano

NaCl

– cloreto de sódio

HPO

– fosfato de sódio dibásico

NBT

– Nitro blue tetrazolium chloride

– nanograma

– células natural killers

– nanômetros

– não-estrutural

NS1

– proteína não-estrutural do vírus da dengue NS1

NS2a

– proteína não-estrutural do vírus da dengue NS2a

NS2b

– proteína não-estrutural do vírus da dengue NS2b

NS3

– proteína não-estrutural do vírus da dengue NS3

NS3hel

– domínio helicase da proteína não-estrutural NS3

NS3pro

– domínio protease da proteína não-estrutural NS3

NS3-209pBAC

– clone infeccioso de dengue 1 pBACDV1 contendo mutação na

posição 209 da proteína NS3

NS3-435pBAC

– clone infeccioso de dengue 1 pBACDV1 contendo mutação na

posição 435 da proteína NS3

NS3-480pBAC

– clone infeccioso de dengue 1 pBACDV1 contendo mutação na

posição 480 da proteína NS3

NS4a

– proteína não-estrutural do vírus da dengue NS4a

NS4b

– proteína não-estrutural do vírus da dengue NS4b

NS5

– proteína não-estrutural do vírus da dengue NS5

– nucleotídeos

N-terminal

– porção amino-terminal

NTP

– nucleosídeo 5’-trifosfatado

NTR

– não traduzida

ºC

– grau Celsius

OMS

– Organização Mundial de Saúde

ORF

– quadro aberto de leitura (open reading frame)

– aminoácido prolina

PAHO

– Pan American Health Organization

– pares de bases

pBACDV1

– clone infeccioso de dengue 1 (cepa BR/90)

PBS

– phosphate buffered saline

PBMC

– células polimorfonucleares

PCR

– reação em cadeia da polierase (polymerase chain reaction)

PEG

– polyethylene glycol

– peptídeo de fusão

Phe

– aminoácido fenilalanina

pmol/!L

– picomol por microlitro

prM

– proteína de pré-membrana do vírus da dengue

prM/E

– quimera construída com as proteína prM e de envelope

Pro

– aminoácido prolina

Profa

– professora

prom

– promotor

Psmb8

– gene proteosome subunit beta type 8

PUC/PR

– Pontifícia Universidade Católica do Paraná

– aminoácido glutamina

qPCR

– reação em cadeia da polimerase em tempo real

QRRGRVGR

– sequência de aminoácidos do motivo VI das RNA helicases,

glutamina-arginina-arginina-glicina-arginina-valina-glicina-arginina

qRT-PCR

– transcrição reversa associada à reação em cadeia da polimerase

em tempo real

– aminoácido arginina

RdRp

– RNA polimerase dependente de RNA

– retículo endoplasmático

RNA

– ácido ribonucléico

RT-PCR

– transcrição reversa associada à reação em cadeia da polimerase

– aminoácido serina

SDS

– Sodium Dodecyl Sulfate

seg.

– segundos

SFB

– soro fetal bovino

– estruturas secundárias em forma de grampo de cabelo

(hairpin/stem-loop)

SLEV

– vírus da encefalite de Saint Louis

SNC

– sistema nervoso central

(-) ssRNA

– RNA simples fita polaridade negativa

(+) ssRNA

– RNA simples fita polaridade positiva

SVS/MS

– Secretaria de Vigilância em Saúde do Ministério da Saúde

– aminoácido treonina

– bacteriófago T7

– meio de cultivo de bactérias Terrific Broth

TBEV

– vírus da encefalite causada por carrapatos

term

– terminador

TGN

– rede trans-Golgi

Thr

– aminoácido treonina

TMEV

– vírus da encefalomielite murina de Theiler

TNE

– tampão para gradiente de sacarose

TNF"

– fator de necrose tumoral alfa (tumor necrosis factor-alpha)

– cepa de baixa virulência do vírus da encefalomielite murina de

Theiler

TOP10

– linhagem comercial bacteriana de Escherichia coli

TOP10F’

– linhagem comercial bacteriana de Escherichia coli

TPP

– marca das garrafas de cultivo celular

Tyr

– aminoácido tirosina

U/!L

– unidades por microlitro

UAR

– upstream UAG region

UFPR

– Universidade Federal do Paraná

USP18

– gene ubiquitin specific protease 18

– aminoácido valina

– volts

v/v

– volume/volume

Val

– aminoácido valina

VLPs

– partículas semelhantes a vírus (virus like particles)

WHO

– World Health Organization

WNV

– vírus da febre do Oeste do Nilo (West Nile virus)

– cepa de baixa virulência do vírus da encefalomielite murina de

Theiler

X-Gal

– bromo-chloro-indolyl-galactopyranoside

– força da gravidade

– aminoácido tirosina

YFV

– vírus da febre amarela (yellow fever virus)

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO.....................................................................................................

1.1 A dengue.........................................................................................................

1.2 A dengue no Brasil..........................................................................................

1.3 O mosquito vetor e o ciclo de transmissão.....................................................

1.4 O vírus.............................................................................................................

1.4.1 Regiões não-traduzidas.........................................................................

1.4.2 Proteínas estruturais..............................................................................

1.4.3 Proteínas não-estruturais.......................................................................

1.5 Morfogênese viral............................................................................................

1.6 Patogênese.....................................................................................................

1.6.1 Modelo murino no estudo da patogênese da dengue............................

1.7 Clones infecciosos e replicons como ferramentas genéticas.........................

2. JUSTIFICATIVA E OBJETIVOS..........................................................................

3. MATERIAIS E MÉTODOS...................................................................................

3.1 Construção de clones recombinantes.............................................................

3.1.1

Amplificação dos fragmentos contendo as mutações de interesse......

3.1.2

Clonagem dos fragmentos mutados em vetor pGEM-T Easy...............

3.1.3

Preparo de células bacterianas de Escherichia coli (E.coli) linhagens

TOP10 e TOP10F’ cálcio competentes.................................................

3.1.4

Transformação de bactérias cálcio-competente TOP10F’ com

plasmídeos pGEM-T Easy....................................................................

3.1.5

Minipreparação do DNA plasmidial dos clones recombinantes em

pGEM-T Easy e sequenciamento.........................................................

3.1.6

Minipreparação do genoma infeccioso pBACDV1................................

3.1.7

Sub-clonagem em pBACDV1 – clones com mutação única.................

3.1.8

Transformação de bactérias cálcio-competente TOP10 com

plasmídeos pBACDV1...........................................................................

3.1.9

Seleção de clones recombinantes pela técnica de PCR de colônia e

confirmação por digestão......................................................................

3.1.10

Minipreparação dos clones recombinantes pBACDV1-mut e

sequenciamento....................................................................................

3.1.11

Construção de clones recombinantes – duplos e triplo mutantes.........

3.2. Geração de vírus recombinantes...................................................................

3.2.1

Linearização dos clones recombinantes por digestão..........................

3.2.2

Transcrição in vitro................................................................................

3.2.3

Determinação da linhagem celular e método de transfecção...............

3.2.3.1 Eletroporação.................................................................................

3.2.3.2 Transfecção por lipossomos...........................................................

3.2.4

Transfecção de RNA recombinante em células de inseto C6/36..........

3.2.5

Titulação viral por imunodetecção de foco............................................

3.2.6

Amplificação de estoques virais em cultura de células de inseto.........

3.2.7

Purificação viral em gradiente de sacarose..........................................

3.2.8

Sequenciamento completo dos vírus recombinantes............................

3.3. Análise in vitro dos vírus recombinantes........................................................

3.3.1

Análise comparativa do efeito citopático dos vírus recombinantes e

controles em cultura de células de inseto C6/36...................................

3.3.2

Imunofluorescência indireta de cultura de células de inseto C6/36

com os vírus recombinantes e controles...............................................

3.4 Análise in vivo dos vírus recombinantes.........................................................

3.4.1

Inoculação de camundongos – ensaio de DL50 do genoma

infeccioso pBACDV1 e infecção com vírus recombinantes e controles

3.4.2

Extração RNA de tecido cerebral infectado com vírus recombinantes

e controles.............................................................................................

3.4.3

Avaliação de possível contaminação com vírus da encefalomielite

murina de Theiler no sistema nervoso central de camundongos por

PCR em tempo real...............................................................................

3.4.4

Análise da replicação viral dos vírus dengue recombinantes e

controles no sistema nervoso central de camundongos por PCR em

tempo real.............................................................................................

3.4.5

Análise do perfil da expressão gênica no sistema nervoso central de

camundongos infectados com vírus recombinantes e controles por

PCR em tempo real...............................................................................

3.4.6

Análise histopatológica dos vírus recombinantes e controles...............

3.5. Novas mutações NS3-480.............................................................................

4. RESULTADOS.....................................................................................................

4.1

Localização das mutações no genoma viral................................................

4.2

Construção de clones recombinantes..........................................................

4.3

Geração de vírus recombinantes.................................................................

112

4.3.1

Preparação do DNA dos clones e transcrição in vitro...........................

112

4.3.2

Determinação da linhagem celular e método de transfecção...............

114

4.3.3

Transfecção de RNA recombinante em células de inseto C6/36..........

116

4.3.4

Amplificação de estoques virais em cultura de células de inseto e

purificação viral em gradiente de sacarose...........................................

117

4.4

Caracterização genética completa dos vírus recombinantes.......................

118

4.5

Análise comparativa do efeito citopático produzido pelos vírus

recombinantes em culturas de células de inseto C6/36...............................

123

4.6

Análise comparativa do padrão de infecção dos vírus recombinantes por

imunofluorescência indireta em cultura de células de inseto C6/36............

126

4.7

Ensaio de DL50 para inoculação do genoma infeccioso pBACDV1, vírus

recombinantes e controles, em camundongos neonatos.............................

128

4.8

Exclusão de possível contaminação com vírus da encefalomielite murina

de Theiler no sistema nervoso central de camundongos por PCR em

tempo real....................................................................................................

130

4.9

Análise das taxas de replicação viral dos vírus recombinantes no SNC de

camundongos por PCR em tempo real........................................................

132

4.10

Análise do perfil da expressão gênica no SNC de camundongos

infectados com vírus recombinantes por PCR em tempo real.....................

133

4.11

Análise histopatológica e imunohistoquimica do tecido cerebral dos

camundongos infectados com vírus recombinantes....................................

135

4.12

Construção de novos clones contendo aminoácidos de diferentes famílias

na posição NS3-480.....................................................................................

142

5. DISCUSSÃO........................................................................................................

148

6. CONCLUSÕES....................................................................................................

166

7. PERSPECTIVAS..................................................................................................

168

REFERÊNCIAS.......................................................................................................

169

APÊNDICES............................................................................................................

205

A. ARTIGOS PUBLICADOS………………………………………………………….

205

ANEXOS..................................................................................................................

232

A. SOLUÇÕES E TAMPÕES...............................................................................

232

B. MEIOS DE CULTURA.....................................................................................

233

C. LINHAGENS BACTERIANAS DE Escherichia coli..........................................

233

1. INTRODUÇÃO

1.1 A dengue

A dengue é a principal arbovirose (doença viral transmitida por artrópodes)

tropical transmitida ao homem através de mosquitos fêmeas hematófagos do gênero

Aedes (HENCHAL; PUTNAK, 1990), e está distribuída por todas as regiões tropicais

e sub-tropicais do planeta (Figura 1.1), sendo hoje um dos principais problemas de

saúde pública no mundo (GUZMÁN, M.; KOURI, 2003; WHO, 2008). Estima-se que

cerca de 2,5 bilhões de pessoas vivem em áreas de risco, principalmente no sul e

sudeste da Ásia, Américas Central e do Sul e Caribe (WHO, 2009). Além disso,

cerca de 80 milhões de pessoas se infectam anualmente e mais de 550 mil

necessitam de hospitalização com pelo menos 20 mil casos de morte decorrente da

doença (WHO, 2007).

Figura 1.1 – Distribuição mundial das áreas de risco de dengue (laranja) em 2008. * As linhas de

contorno das isotermas de janeiro e julho (vermelho) indicam as áreas de risco, definidas pelos limites

geográficos dos hemisférios norte e sul para o ciclo de sobrevivência do Aedes aegypti, o principal

mosquito vetor dos vírus da dengue. (WHO, 2008).

A emergência global da dengue está diretamente ligada à carência de um

programa eficiente de combate ao mosquito transmissor em áreas onde a dengue é

endêmica. Além disso, o aumento populacional mundial, a rápida urbanização e o

crescente número de viagens aéreas internacionais contribuem para a manutenção

e aumento de epidemias de dengue no mundo (KYLE; HARRIS, 2008)

Apesar dos esforços das pesquisas (WEBSTER; FARRAR; ROWLAND-

JONES, 2009) e da necessidade imediata, não existem vacinas contra a dengue

disponíveis para a população, e seu desenvolvimento esbarra em várias limitações.

A vacina deve conferir proteção de longa duração contra os quatro sorotipos do

vírus, não há um modelo animal adequado capaz de reproduzir as formas graves de

dengue (BENTE; RICO-HESSE, 2006) e ainda existe o fenômeno da infecção

secundária potencializada pelos anticorpos heterólogos (ADE) (HALSTEAD;

O’ROURKE, 1977). Além disso, existem relatos na literatura sobre a capacidade de

recombinação (HOLMES et al., 1999; TOLOU et al., 2001; ABUBAKAR; WONG;

CHAN, 2002; CARVALHO et al., 2010) e de interferência viral entre sorotipos (SUN

et al., 2006; GUY et al., 2009).

1.2 A dengue no Brasil

No Brasil, a dengue tem sido objeto de uma das maiores campanhas de

saúde pública realizadas nos últimos anos (http://www.combatadengue.com.br). O

mosquito transmissor da doença, o Aedes aegypti, que havia sido erradicado de

vários países do continente americano nas décadas de 50 e 60, volta a se

disseminar na década de 70 e hoje é detectado em praticamente todo território

nacional (Figura 1.2). Este fato deve-se a falhas no sistema de vigilância

epidemiológica e pelas mudanças sociais e ambientais (GUZMÁN; KOURI, 2003;

TAPIA-CONYER; MÉNDEZ-GALVÁN; GALLARDO-RINCÓN, 2009).

Em 1986, após um período de mais de 60 anos sem notificação, o vírus da

dengue (sorotipo 1, DENV1) foi detectado no Brasil, inicialmente no estado do Rio

de Janeiro, causando uma grande epidemia (SCHATZMAYR et al., 1986). Em 1990,

quatro anos após a re-introdução da doença, foi detectado o primeiro caso de

dengue causado pelo sorotipo 2 do vírus (DENV2) (NOGUEIRA et al., 1990) e, em

2000, do sorotipo 3 (DENV3) (NOGUEIRA et al., 2001), ambos também no Rio de

Janeiro. Com a co-circulação dos três sorotipos ocorreu, em 2002, a mais grave

epidemia de dengue no país (Figura 1.3). O sorotipo 4 foi identificado no Brasil por

um grupo do Amazonas em amostras coletadas de três pacientes residentes em

Manaus, em 2006 (FIGUEIREDO et al., 2008; DE MELO; ROMANO; ZANOTTO,

2009), porém existem controvérsias com relação a origem desses casos e este dado

não é confirmado pelo Ministério da Saúde.

No Brasil, atualmente ocorre a co-circulação de DENV1, DENV2 e DENV3

em todas as regiões do país, sendo que apenas o estado de Santa Catarina não

apresentou casos autóctones na última epidemia de 2009 (MINISTÉRIO DA SAÚDE,

2009). Atualmente, o Brasil se encontra em uma situação epidemiológica alarmante,

e contribui com 80% dos casos de dengue registrados nas Américas (NOGUEIRA;

ARAÚJO; SCHATZMAYR, 2007; TEIXEIRA et al., 2009).

Figura 1.2 – Reinfestação do mosquito Aedes aegypti na América Latina e Caribe. Figuras

compiladas por PAHO. Áreas infestadas marcadas em amarelo. (TAPIA-CONYER

MÉNDEZ-GALVÁN; GALLARDO-RINCÓN, 2009).

De acordo com dados epidemiológicos de 2009 da Secretaria de Vigilância

em Saúde do Ministério da Saúde (SVS/MS), foram confirmados 1.386 casos de

febre hemorrágica da dengue (DHF), com 98 óbitos. Também foram confirmados

2.510 casos de dengue com complicação (DCC) com 58 óbitos. Em 2008, no

mesmo período, ocorreram 3.660 casos de DHF e 16.569 de DCC, o que mostra

uma importante redução de 80,7% no número de casos graves em 2009. Além

disso, a análise do monitoramento da circulação viral demonstra o isolamento dos

sorotipos DENV1, DENV2 e DENV3, com o predomínio para o sorotipo DENV2, em

50% dos casos de isolamento de 2009 (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2009).

Número de casos confirmados

Anos de epidemia

Figura 1.3 – Número de casos de dengue no Brasil de 1986 a 2009. (Dados

obtidos do Ministério da Saúde e Secretaria de Vigilância em Saúde).

1.3 O mosquito vetor e o ciclo de transmissão

Várias espécies de mosquito do gênero Aedes podem agir como vetor para

DENV, dependendo da área geográfica e do tipo de ciclo de transmissão, entre elas

A. albopictus, A. aegypti e A. polynesiensis, sendo as duas primeiras encontradas

em diversas regiões do Brasil e o A. aegypti, o principal vetor urbano da dengue

(GUBLER, 1998; WEAVER; BARRET, 2004).

Atualmente, o mosquito transmissor é encontrado numa larga faixa do

continente americano (GUZMÁN; KOURI, 2003), desde o Uruguai até o sul dos

Estados Unidos. Há registro de surtos importantes de dengue em vários países

como Venezuela, Cuba, Brasil e Paraguai (SEIJO et al., 2001; THOMAS et al., 2003;

CARVALHO et al., 2010).

No Brasil, o mosquito está restrito às vilas e cidades, sempre ligado ao

peridomicílio e domicílio humano, e raramente em ambientes semi-silvestres. É

pequeno, preto e branco, altamente adaptado ao ambiente doméstico, tem hábito

diurno e deposita seus ovos em recipientes contendo água limpa parada (GUBLER,

1998; THOMAS et al., 2003; MALAVIGE et al., 2004; WEAVER; BARRET, 2004).

A infecção pelo vírus da dengue ocorre através da picada de fêmeas de

mosquitos do gênero Aedes. Após a picada por um mosquito infectado, o vírus

inicia, no indivíduo, um período de incubação que leva de 3 a 14 dias, passando a

causar sintomas e sinais não-específicos, além de febre (SILER et al., 1926).

Durante o período febril, que varia de 2 a 10 dias, as partículas virais circulam no

sangue periférico (GUBLER et al., 1981) podendo assim ser transmitidas caso um

mosquito venha a picar a pessoa doente. Os mosquitos então se tornam infectados

e, após um período de incubação de 8 a 12 dias, denominado período de incubação

extrínseca, passam a transmitir o vírus (GUBLER, 1998; THOMAS et al., 2003).

1.4 O vírus

O vírus da dengue (DENV) pertence ao gênero Flavivirus da família

Flaviviridae (CALISHER, 1988), uma grande família de patógenos virais

responsáveis por inúmeras doenças e mortalidade em humanos e animais. O nome

Flavivirus tem origem do latim, onde “flavus” significa amarelo, relacionando à

icterícia causada pela febre amarela (YFV). Este gênero compreende mais de 70

vírus, incluindo, além da dengue e febre amarela, os vírus da encefalite japonesa

(JEV), encefalite causada por carrapatos (TBEV), febre do oeste do Nilo (WNV)

(MUKHOPADHYAY; KUHN; ROSSMANN, 2005), entre outros. O DENV pode ser

classificado em quatro sorotipos distintos: DENV1, DENV2, DENV3 e DENV4, que

embora epidemiologicamente semelhantes, são geneticamente e antigenicamente

distintos, e a infecção por qualquer um dos quatro causa manifestações clínicas

similares (CALISHER et al., 1989).

O virion maduro é uma partícula esférica com diâmetro entre 40 e 60 nm, e é

composto por uma única molécula de RNA de fita simples com polaridade positiva,

empacotada pela proteína viral de capsídeo (C) e uma bicamada lipídica derivada da

célula hospedeira. Esta camada é envolta por 180 cópias das glicoproteínas de

envelope (E) (KUHN et al., 2002) e de membrana (M), que estão ancoradas na

membrana lipídica por seus domínios C-terminal (LINDENBACH; RICE, 2001;

MUKHOPADHYAY; KUHN; ROSSMANN, 2005) (Figura 1.4).

Figura 1.4 – Representação de partículas de Flavivirus imaturas. A – Reconstrução da

estrutura sombreada de crio-microscopia eletrônica (cryoEM) de uma partícula imatura de

DENV2 numa resolução de 16Å. B – Superposição da proteína E em cima da densidade

cryoEM. A preteína prM que cobre o trimero é visível. C – Organização da proteína E na

partícula imatura. (MUKHOPADHYAY; KUHN; ROSSMANN, 2005).

O genoma viral contém aproximadamente 11.000 nucleotídeos (nt) e possui

uma única fase de leitura (ORF) que codifica uma poliproteína, que é flanqueada por

duas regiões não traduzidas (NTR) (Figura 1.5) (CHAMBERS et al., 1990; RICE,

1996), que parecem ser responsáveis por conferir estabilidade ao RNA viral, além de

desempenharem um papel importante na regulação da síntese de moléculas de

RNA e na expressão das proteínas virais (KHROMYKH et al., 2001; ALVAREZ et al.,

2005a; CHIU; KINNEY; DREHER, 2005), e que provavelmente interagem com

fatores celulares envolvidos nestas funções. O RNA genômico possui um cap na

região 5’NTR e não apresenta cauda poli(A) na região 3’NTR. O cap desempenha

um papel importante atuando no início do processo de tradução e protegendo o RNA

viral de degradação por exonucelases (BOLLATI et al., 2009). A tradução da ORF

resulta em uma única poliproteína precursora, de aproximadamente 3.390

aminoácidos (aa), que é clivada co- e pós-traducionalmente por proteases virais e

derivadas do hospedeiro, gerando um conjunto de três proteínas estruturais (C, prM

e E), e de sete proteínas não estruturais (NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A, NS4B e

NS5) (CHAMBERS et al., 1990; RICE, 1996; MURRAY; JONES; RICE, 2008)

(Figura 1.5).

Figura 1.5 – Representação esquemática da organização do genoma do vírus da dengue e

clivagem da poliproteína em três proteínas estruturais e sete não-estruturais por proteases

viral e do hospedeiro.

1.4.1 Regiões não-traduzidas

As regiões 5’ e 3’NTR apresentam sequências conservadas (conserved

sequences, CSs) que parecem desempenhar papéis importantes no processo de

replicação do genoma viral (HAHN et al., 1987; KHROMYKH et al., 2001; ALVAREZ

et al., 2005a; VILLORDO; GAMARNIK, 2009). O fragmento 5’CS, localizado na

região que codifica a porção N-terminal da proteína C, é complementar a 3’CS,

situado no 3’NTR. A região 5’UAR, localizada antes do AUG que codifica o primeiro

aminoácido da poliproteína, é complementar a 3’UAR, situada no 3’SL (stem-loop)

(Figura 1.6) (ALVAREZ et al., 2005a; VILLORDO; GAMARNIK, 2009). Tem sido

descrito que essa complementaridade é essencial para a replicação viral em cultura

celular (BREDENBEEK et al., 2003; LO et al., 2003; ALVAREZ et al., 2005a,

ALVAREZ et al., 2005b), o que corrobora com a hipótese de que a circularização do

RNA é necessária para o sucesso do ciclo replicativo (KHROMYKH et al., 2001).

Figura 1.6 – Representação de uma porção das sequências e predição das

estruturas secundárias das regiões 5’NTR e 3’NTR, indicando seus

elementos: 5’SLA (5’ stem-loop A), 5’SLB (5’ stem-loop B), 5’cHP (5’ capsid

region hairpin) e 3’SL (3’ stem-loop). A linha pontilhada representa o genoma

viral. (Modificado de VILLORDO; GAMARNIK; 2009).

1.4.2 Proteínas estruturais

A proteína do capsídeo (C), responsável pela forma estrutural da partícula

viral, possui caráter básico e sua região C-terminal pode estar envolvida na

associação ao RNA viral (MA et al., 2004; WANG et al., 2002). Sugere-se que esta

associação forme um complexo evitando o contato do RNA com a proteína de

envelope (MURRAY; JONES; RICE, 2008). Apesar do processo de recrutamento de

partículas de RNA e proteínas C para a formação do nucleocapsídeo não ser muito

bem compreendida, a interação entre a proteína e o RNA parece ser crucial para a

produção de partículas virais viáveis (JONES et al., 2003).

A proteína glicosilada prM faz parte da estrutura dos virions imaturos e é

clivada por uma protease tipo furina como última etapa antes da liberação da

partícula infecciosa da célula, protegendo a proteína fusogênica de envelope durante

seu trânsito pelos compartimentos ácidos da via secretória (MURRAY; JONES;

RICE, 2008). Esta clivagem gera a proteína estrutural M, que juntamente com E

formam a estrutura externa da partícula viral madura (CHAMBERS et al., 1990;

RICE, 1996; MUKHOPADHYAY; KUHN; ROSSMANN, 2005).

A proteína de envelope (E) é uma proteína de fusão da classe II (KIELIAN,

2006), sendo responsável pelas principais propriedades biológicas do vírus. Além de

ser o principal componente antigênico da superfície do virion (GROMOWSKI;

BARRETT, 2007), age como hemaglutinina viral, apresenta capacidade fusogênica

com membranas da célula hospedeira (STIASNY et al., 2009), induz resposta imune

protetora (WAHALA et al., 2009) e interage com receptores na superfície de células

alvo (CHEN; MAGUIRE; MARKS, 1996; HUERTA et al., 2008). A proteína E possui

dois sítios de N-glicosilação, nas posições Asn-67 e Asn-153, sendo a glicosilação

no sítio Asn-153 conservada na maioria dos Flavivirus e Asn-67 exclusiva dos vírus

dengue (HEINZ; ALLISON, 2003; BRYANT et al., 2007; MONDOTE et al., 2007).

Evidências indicam que a proteína E desempenha um papel na patogenicidade de

diversos flavivírus, não apenas pela definição do tropismo celular como também

afetando a penetração do vírus (GOLLINS; PORTERFIELD, 1986; REY et al., 1995).

A estrutura cristalográfica da proteína E já foi descrita para os Flavivirus DENV1,

DENV2, DENV3, TBEV e WNV (NAYAK et al., 2009; BRESSANELLI et al., 2004;

MODIS et al., 2003; 2004; 2005; REY et al., 1995; ZHANG et al., 2004; KANAI et al.,

2006; NYBAKKEN et al., 2006), o que possibilitou a obtenção de informações com

relação à disposição espacial das proteínas de superfície, sua função e os

mecanismos de fusão. O monômero nativo da proteína E é formado por três

domínios distintos: I, II e III. O domínio I é formado por 8 fitas de !-barril contendo 2

inserções em loop e 2 "-hélices que funcionam como uma dobradiça para a

reorganização da proteína E em meio de pH baixo. O domínio II contém o peptídeo

de fusão (PF – aa 98–111), uma região altamente conservada entre os Flavivirus. O

PF reage com anticorpos monoclonais que possuem reação cruzada entre Flavivirus

e com inibidores da fusão de membranas. É responsável pelo início do processo de

fusão entre as membranas do virion e do endossomo. O domínio III é formado por

10 fitas de !-barril tipo-imunoglobulina, com motivos putativos de ligação de receptor

celular e elícita altos títulos de anticorpos neutralizantes específicos (HUANG et al.,

2010). A região logo abaixo do domínio III representa a porção C-terminal, que é

formada por uma haste e uma âncora transmenbrana (Figura 1.7), e que

corresponde a 20% da proteína E, para a qual apenas estruturas preditas, baseadas

em sequências nucleotídicas, estão disponíveis. A haste é composta por duas

estruturas em "-hélice chamadas H1

pred

(aa 401–413) e H2

pred

(aa 431–449) que são

separadas por um elemento CS (aa 414–430). Na âncora transmenbrana estão os

segmentos TM1 (aa 450–471) e TM2 (aa 473–496). H2

pred

é contíguo ao TM1 e

juntos constituem uma "-hélice contínua que se estende até a membrana viral. TM2,

que possui função de sequência sinal para a proteína NS1, foi também descrito

cruzando a membrana viral, mas não se sabe ao certo se realmente permanece

embebida na membrana após a clivagem por signalases, que separa E e NS1

durante o processamento da poliproteína viral (ALLISON et al., 1999).

1.4.3 Proteínas não-estruturais

As proteínas não-estruturais são essenciais para a replicação do RNA viral,

estando envolvidas no complexo de replicação viral (CR) (BOLLATI et al., 2009). A

glicoproteína não-estrutural NS1 pode ser detectada em células de vertebrados,

intracelularmente, associada a superfície celular ou secretada no meio extracelular

sob a forma hexamérica (WINKLER et al., 1988; 1989; FLAMAND et al., 1999) e

também no soro de pacientes infectados com o vírus (LIBRATY et al., 2002;

RAMIREZ et al., 2009). Os níveis dessa proteína circulante no soro de pacientes

infectados têm sido correlacionados com a gravidade da doença (AVIRUTNAN et al.,

2006). Tanto as formas solúveis da proteína NS1 ou associadas à superfície celular

podem desempenhar um importante papel na patogênese da dengue (LIBRATY et

al., 2002; ALCON-LEPODER et al., 2005), provocando a formação auto-anticorpos

que reagem com plaquetas e proteínas da matriz extracelular induzindo disfunção

plaquetária e hemorragia (FALCONAR, 1997; CHANG et al. 2002, 2009; SUN et al.,

2007), pode diretamente reforçar a infecção (ALCON-LEPODER et al., 2005), ou

ainda promover a formação do complexo terminal do complemento (KUROSU et al.,

2007). Estudos demonstraram que a proteína NS1 foi identificada sendo um

determinante grupo e sorotipo-específicos, e marcador de diagnóstico precoce

(FALCONAR; YOUNG, 1991; HENCHAL et al., 1987; SHU et al., 2000). Além disso,

Figura 1.7 – Representação esquemática da vista lateral de um homodímero da

proteína E e seus elementos: domínios I em vermelho, domínio II em amarelo,

domínio III em azul, peptídeo de fusão (PF) em laranja, haste em roxo e âncora

transmembrana em verde, além da membrana viral em cinza (modificado de

KIERMAYR; STIASNY; HEINZ, 2009).

foi demonstrado que a NS1 de flavivírus desempenha um papel essencial no

processo de replicação viral (MACKENZIE; JONES; YOUNG, 1996; MUYLAERT;

GALLER; RICE, 1997; LINDENBACH; RICE, 1997), porém, sua função direta ainda

não é conhecida. Entretanto, foi comprovado que o sítio de glicosilação, localizado

na posição 130 da proteína NS1, é necessário para replicação viral (TAJIMA;

TAKASAKI; KURANE, 2008).

A proteína NS3 está envolvida no processamento da poliproteína e na

replicação do genoma viral. É uma proteína multifuncional com no mínimo três

atividades distintas (ASSENBERG et al., 2009). A região N-terminal (180 resíduos

de aminoácidos – NS3pro), tendo como co-fator o domínio hidrofóbico da proteína

NS2B, apresenta atividade de serina-protease, catalisando as clivagens de várias

proteínas virais (CHEN et al., 1997; LI et al., 1997; CUI et al., 1998; KHROMYKH et

al., 1999a, 1999b; LINDENBACH; RICE, 2003). Os dois terços finais da proteína

NS3 (região C-terminal) apresentam homologia com a família das RNA helicases

(GORBALENYA et al., 1989; XU et al., 2005; SAMPATH et al., 2006). Além disso,

também possui atividade de RNA trifosfatase, que promove a desfosforilação da

região 5’NTR para a adição do cap (WENGLER; WENGLER, 1991; KHROMYKH et

al., 1999a, 1999b, LINDENBACH; RICE, 2003). O fragmento correspondente aos

resíduos de aminoácido 180 a 618 da NS3 de DENV compreende dois motivos

chamados Walker A GK(S/T) e Walker B DEx(D/H). Estes motivos estão presentes

em uma vasta família de proteínas ligadoras de nucleotídeos que participam de uma

grande variedade de funções celulares como hidrólise de nucleosídeos 5’-

trifosfatados (NTP) com movimento direcional, desestabilização de fitas duplas de

ácido nucléico, processamento de RNA, além de recombinação e reparo de DNA

(SINGLETON; WIGLEY, 2002). As helicases são enzimas motoras que utilizam a

energia derivada da hidrólise de NTP para catalisar o desenovelamento e

remodelamento de fitas duplas de ácido nucléico, e são classificadas em 3 grandes

superfamílias, baseado na comparação de sequências e motivos conservados. Além

disso, as helicases ainda podem ser classificadas nas subfamílias DEAD, DExD e

DExx, dependendo da sequência do motivo II (SCHMID; LINDER, 1992). As

helicases se ligam a NTP por dois elementos estruturais, o motivo I ou Walker A,

que é um loop de ligação a fosfato, e o motivo II ou Walker B, que é um loop de

ácido aspártico de ligação a Mg

(KOONIN, 1991). A presença dos motivos Walker

A e Walker B e de outros cinco motivos conservados, classifica a helicase de DENV

dentro da superfamília 2 das RNA helicases/NTPases (UTAMA et al., 2000a). A

superfamília 2 das RNA helicases, também chamada helicases DEAD(D/H)-box,

possui sete motivos conservados, que sugerem estar associados à hidrólise de NTP

e ligação à ácidos nucléicos (YAMASHITA et al., 2008). A helicase de DENV é

formada por três subdomínios com tamanhos aproximadamente iguais formando, na

sua junção, uma grande fissura positivamente carregada, onde se encontra o sitio de

ligação ao RNA (ASSENBERG et al., 2009). Os sete motivos conservados da

superfamília 2 estão localizados nos subdomínios 1 e 2 (Figura 1.8). O subdomínio 1

é composto por quatro !-hélices e cinco folhas-", e possui os motivos Walker A

(motivo I, GSGKT) e Walker B (motivo II, DEAH). O subdomínio 2 é composto por

três !-hélices e oito fitas-" e é dividido em duas subunidades. Uma subunidade é

cercada por seis fitas-" e três !-hélices, enquanto a outra subunidade possui duas

fitas-" penetrando no domínio 3. Acredita-se que o “dedo de arginina” no motivo VI

(QRRGRVGR) no subdomínio 2 seja crucial para a hidrólise de NTP (AHMADIAN et

al., 1997). O subdomínio 3 é composto de sete !-hélices e duas fitas-"

(YAMASHITA et al., 2008). As atividades helicase e NTPase da proteína NS3 já

foram caracterizadas funcionalmente para diversos membros da família Flaviviridae,

como o vírus da hepatite C (HCV), DENV, WNV, YFV e JEV (WARRENER;

TAMURA; COLLETT, 1993; GWACK et al., 1996; BOROWSKI et al., 2001; UTAMA

et al., 2000b; BENARROCH et al., 2004), e a estrutura cristalográfica do domínio

helicase já foi descrita para os Flavivirus DENV, YFV, JEV, KUNV (XU et al., 2005;

WU et al., 2005; MASTRANGELO et al., 2007; YAMASHITA et al., 2008).

A maior das proteínas não estruturais (NS5) apresenta sequências

conservadas entre os membros do gênero Flavivirus, e possui dois domínios

caracterizados. A região N-terminal da proteína apresenta atividade de

metiltransferase (MTase), que está associada com a reação de adição do cap ao

RNA (KOONIN, 1993; LINDENBACH; RICE, 2003). A região C-terminal apresenta

motivos de atividade de RNA polimerase dependente de RNA (RdRp) (replicase

viral) (KAMER; ARGOS, 1984; CHAMBERS et al., 1990; BRUENN, 2003). A

estrutura cristalográfica da MTase já foi determinada para DENV (EGLOFF et al.,

2002), WNV (ZHOU et al., 2007) e YFV (GEISS et al., 2009), além de outros

flavivírus trasnmitidos por carrapatos (BOLLATI et al., 2009). Enquanto apenas duas

estruturas de RdRp de flavivírus são conhecidas, KUNV (MALET et al., 2007) e

DENV3 (YAP et al., 2007). Ambas estruturas de RdRp adotam a estrutura típica de

“mão direita”, compreendendo três domínios, denominados dedos, palma e polegar

(MALET et al., 2008). A região entre os resíduos de aminoácidos 320 a 368 é

Figura 1.8 – Representação esquemática do genoma e estrutura tri-

dimensional do domínio helicase da proteína NS3 de JEV. A – Estrutura do

genoma de JEV com destaque para os sete motivos conservados do domínio

helicase. B – Diagrama em fita do domínio helicase de JEV mostrando os

domínios 1 e 2 no topo e o domínio 3 na parte inferior em vista lateral

(esquerda) e vista superior (direita). Os sete motivos estão representados por

cores distintas: motivo I, roxo; motivo Ia, vermelho; motivo II, ciano; motivo III,

laranja; motivo IV, rosa; motivo V, azul e motivo VI, verde. (modificado de

YAMASHITA et al., 2008)

extremamente conservada entre os flavivírus e está implicada na interação com a

proteína NS3 (KAPOOR et al., 1995a; JOHANSSON et al., 2001). Nas infecções por

DENV, a proteína NS5 foi localizada dentro do núcleo, entretanto, isso não é comum

entre todos os flavivírus. A explicação para esta localização nuclear, uma vez que a

função enzimática da RdRp no ciclo de vida do vírus é requerida no citoplasma de

célula, é desconhecida, mas está sendo investigada (PRYOR et al., 2007). No

entanto, estas observações sugerem que, além de suas funções enzimáticas, a NS5

também pode participar em interações vírus-hospedeiro, interagindo ativamente com

o hospedeiro (PERERA; KUHN, 2008).

A proteína NS2B age como co-fator da NS3pro, sendo esta interação

responsável pelos eventos de clivagem e maturação da poliproteína viral

(CHAMBERS et al., 1990; FALGOUT et al., 1991; LIN et al., 1993). Não se tem

evidências diretas sobre a função das proteínas NS2A, NS4A e NS4B. No entanto,

estudos sugerem que a proteína NS4A está ancorada à membrana do retículo e

interage com as proteínas NS1, NS3 e NS5 (WESTAWAY; MACKENZIE;

KHROMYKH, 2003). Outros estudos demonstram que durante a replicação viral, a

proteína NS4B pode estar localizada no núcleo da célula hospedeira, e sua

interação com a NS3 pode modular a replicação viral, porém seu papel específico

ainda não foi determinado (LINDENBACH; RICE, 2003; UMAREDDY et al., 2006).

Foi demonstrada a presença da proteína NS2A e possivelmente NS4A associadas a

frações da membrana do retículo endoplasmático, confirmando a presença de

múltiplos domínios hidrofóbicos observados anteriormente (RICE et al., 1986;

MANDL et al., 1989; CHU; WESTAWAY, 1992, KAPOOR et al., 1995a; RICE, 1996;

CHEN et al., 1997; CUI et al., 1998; KHROMYKH et al., 1999a, 1999b). Resultados

recentes sugerem que a proteína NS2A interage com a região 3’NTR

(LINDENBACH; RICE, 2003), e que serve como ponte para a interação das

proteínas NS5 e NS4A. Além disso, a NS2A é necessária para a clivagem

proteolítica da região C-terminal da NS1 (FALGOUT; CHANOCK; LAI, 1989).

Recentemente, foi demonstrado que a NS4B e, com menor importância, a NS2A e

NS4A são capazes de bloquear a via de interferon (IFN) (MUÑOZ-JORDAN et al.,

2003, 2005; LIU et al., 2004). As funções específicas de cada uma destas proteínas

estão sendo determinadas e estudos utilizando a tecnologia de replicons e genomas

infecciosos têm demonstrado que elas estão envolvidas na formação e manutenção

do CR viral (KHROMYKH et al., 1999a, 1999b; LINDENBACH; RICE, 2003).

1.5 Morfogênese viral

A superfície da partícula viral madura de DENV é revestida por uma

armação de 90 cópias da proteína E, organizadas em homodímeros (KUHN et al.,

2002; MUKHOPADHYAY; KUHN; ROSSMANN, 2005), sendo responsável pela

interação entre o vírus e a célula hospedeira. A entrada do vírus na célula alvo

acontece por endocitose mediada pela interação com receptores, porém as

proteínas de superfície celular que estariam envolvidas neste processo ainda não

foram totalmente definidas. Muitos estudos têm sido realizados visando caracterizar

os receptores celulares envolvidos na penetração do DENV nas células hospedeiras,

e no caso de células de vertebrados, vários receptores têm sido propostos, como

heparan sulfato, proteínas de choque térmico 70 (heat shock protein 70, HSP70) e

90 (heat shock protein 90, HSP90), GRP78/BiP, CD14, receptor de 37/67-kDa de

alta afinidade pela laminina, L-SIGN e DC-SIGN (CLYDE; KYLE; HARRIS, 2006),

sendo este último o melhor caracterizado (SAKUNTABHAI et al., 2005; LOZACH et

al., 2005; KWAN et al., 2005; 2008). DC-SIGN são receptores transmembrana tipo-C

(dependente de cálcio), compostos por quatro domínios, um citoplasmático, um

transmembrana, um envolvendo sete a oito prolongamentos extracelulares e um

domínio de reconhecimento de carboidrato. Estes receptores são principalmente

expressos em células dendríticas e macrófagos alveolares (ALEN et al., 2009). O

DC-SIGN é capaz de mediar a infecção dos quatro sorotipos do DENV, e a sua

expressão ectópica confere permissividade à infecção pelo DENV em linhagens

celulares normalmente não permissivas (NAVARRO-SÁNCHEZ et al., 2003;

TASSANEETRITHEP et al., 2003).

Uma vez internalizada no endossomo, a partícula viral encontra um

ambiente ácido, o que desencadeia um rearranjo conformacional na proteína E,

onde ocorre a dissociação de seus dímeros e a re-associação irreversível em

trímeros, expondo o peptídeo de fusão (PF) (MODIS et al., 2004) (Figuras 1.9a-c).

Na conformação pré-fusão, o loop interno do PF está localizado na ponta do domínio

II da subunidade monomérica e está escondido no bolso hidrofóbico formado pela

interação dos domínios I e III da subunidade adjacente (Figura 1.9a). Para o início

da fusão, o PF precisa ser liberado desta interação permitindo sua associação com a

membrana do endossomo. Este passo inicial é então seguido pela trimerização e

realocação do domínio III (STIASNY et al., 2009). O rearranjo sofrido pela proteína E

gera energia necessária capaz de dobrar a membrana da célula em direção à

membrana do vírus, induzindo a fusão das membranas (MODIS et al., 2004). Este

processo se dá pela inserção do peptídeo de fusão na parte externa da bicamada da

membrana celular (Figura 1.9b-c), seguido do dobramento da proteína E,

direcionando a região C-terminal da âncora em direção ao peptídeo de fusão (Figura

1.9c-d). Este dobramento força a membrana da célula (ligada pelo peptídeo de

fusão) contra a membrana viral (ligada pela região C-terminal da âncora

transmembrana), resultando na fusão das duas membranas (Figura 1.9e) (NAYAK et

al., 2009). O processo de fusão é crítico para a entrada do vírus e liberação do

genoma viral no citoplasma da célula, onde ocorre a tradução e replicação

simultânea do RNA viral.

Figura 1.9 – Representação gráfica do mecanismo de fusão mediado por proteínas virais de

fusão da classe II. Os domínios e estruturas da proteína E estão representados como na Figura

1.7. (a) Estrutura da partícula viral pré-fusão, proteína E organizada em homodímeros; (b) O pH

ácido do endossomo induz a dissociação dos dímeros em monômeros expondo o peptídeo de

fusão (PF) e permitindo sua interação com a membrana do endossomo; (c) A inserção do PF

na membrana da célula hospedeira promove a formação do trímero; (d) Os trímeros se unem e

o domínio III é deslocado para promover um dobramento da proteína da porção C-terminal em

direção ao peptídeo de fusão, promovendo uma hemi-fusão; (e) Formação de poros de fusão.

(Modificado de STIASNY et al., 2009)

Uma vez no citoplasma da célula, ocorre a tradução do RNA viral associada

ao retículo endoplasmático (RE), seguida do processo de replicação do RNA viral. A

replicação é semiconservativa, aonde o RNA de polaridade positiva (que atua como

um RNA mensageiro) serve como molde para a síntese de moléculas de RNA de

polaridade negativa, que servirão de molde para geração de novas cadeias de RNA

de polaridade positiva, e também para da tradução das proteínas virais

(WESTAWAY, 1987).

Durante o processo de tradução, as proteínas virais NS são clivadas, por

proteases virais do tipo serina e por signalases da célula hospedeira, e estão

envolvidas no processo de replicação do RNA viral. A proteína NS5, que é uma RNA

polimerase dependente de RNA (RdRp), associa-se a proteína NS3 (BOOKS et al.,

2002) e a outras proteínas virais para formar o complexo de replicação.

A montagem das partículas imaturas é realizada na superfície do RE quando

as proteínas estruturais e as fitas de RNA recém sintetizadas brotam no lúmen do

RE. As partículas não-infecciosas, virais imaturas e sub-virais resultantes são

transportadas através da rede trans-Golgi (TGN), onde ocorre a glicosilação das

proteínas prM, E e NS1. Apesar da biossíntese e montagem da proteína E ocorrer

nas membranas do RE, pouco se sabe sobre a interação de chaperonas do RE no

processo de dobramento e montagem desta proteína. Algumas proteínas estão

sendo investigadas quanto ao seu papel neste processamento, e a imunoglobulina

de cadeia pesada ligadora de proteína, calnexina e calreticulina parecem ser

essenciais para produção viral (LIMJINDAPORN et al., 2009). As partículas imaturas

do virion sofrem uma clivagem tardia pela protease tipo furina do hospedeiro

(clivagem da glicoproteína prM para gerar a proteína M), resultando em partículas

maduras e infecciosas. Esta maturação é necessária para manter a conformação da

proteína E, sem expor o PF, durante o transporte pelas cisternas da TGN, que

apresentam um pH ácido, e assim, manter o potencial de infectividade dos vírus

(HEINZ et al., 1994; HEINZ; ALLISON, 2003; LI et al., 2008). Posteriormente, as

partículas infecciosas resultantes são liberadas para o meio extracelular pelo

mecanismo de exocitose (Figura 1.10) (CHAMBERS et al., 1990; RICE, 1996;

MUKHOPADHYAY; KUHN; ROSSMANN, 2005).

1.6 Patogênese

Os quatro sorotipos de DENV podem ser responsáveis por estados

assintomáticos da doença, febres indiferenciadas e até febres hemorrágicas mortais.

Até o momento, não foi possível associar um sorotipo ou uma variante específicos

do vírus da dengue a um quadro clínico particular.

A febre da dengue (DF) é caracterizada por sintomas inespecíficos como

cefaléia, febre de início súbito, dor retro-orbitária, artralgia, bradicardia, mialgia,

náuseas, vômitos, exantema maculopapular, dor nos ossos e fraqueza generalizada,

podendo ser confundindo com os sintomas de outras doenças infecciosas co-

circulantes. (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2005). Pequenas manifestações

hemorrágicas também podem ser observadas em alguns casos.

Figura 1.10 – Esquema da morfogênese do vírus da dengue. (Modificado de

MUKHOPADHYAY; KUHN; ROSSMANN, 2005)

A febre hemorrágica da dengue (DHF) além dos sintomas da DF se

caracteriza também por hemorragias diversas (que incluem petéquias, púrpuras e

equimoses), trombocitopenia, extravasamento de plasma, que é atribuído pelo

aumento da permeabilidade vascular, e manifestado por valores elevados de

hematócrito, hipoproteinemia ou efusão no interior das cavidades serosas

(ROTHMAN, 1997; WHO, 1997; MALAVIGE et al., 2004). Este quadro pode se

agravar rapidamente e o indivíduo entrar em choque hipovolêmico (síndrome de

choque da dengue - DSS), e evoluir para óbito. Alguns dos mecanismos

fisiopatológicos responsáveis por esse fenômeno ainda são desconhecidos,

principalmente pela falta de um modelo animal que reflita as formas graves da

doença (BENTE; RICO-HESSE, 2006; VASILAKIS; WEAVER, 2008).

Algumas teorias são propostas para explicar o desenvolvimento da DHF.

Mecanismos imunopatológicos desempenhariam um importante papel no

desenvolvimento da DHF/DSS (KURANE; ENNIS, 1994, ROTHMAN; ENNIS, 1999).

Uma prevalência de DHF é observada mais frequentemente após uma infecção

secundária por um segundo sorotipo de vírus da dengue, possivelmente decorrente

do fenômeno dos anticorpos potencializadores da infecção (antibody dependent-

enhancement – ADE) (HALSTEAD; O’ROURKE, 1977; MALAVIGE et al., 2004). Os

anticorpos produzidos durante a primeira infecção seriam não neutralizantes ou sub-

neutralizantes contra o segundo sorotipo, potencializando a infecção através da

interação da porção Fc do complexo partícula viral-imunoglobulina, facilitando a

penetração em células alvo do hospedeiro (HALSTEAD; O’ROURKE, 1977).

Observações recentes indicam que o perfil clínico da doença tem se

modificado e complicações como manifestações neurológicas (SUMARMO et al.,

1978; GUBLER; TRENT, 1993; MIAGOSTOVICH et al., 1997; SANTOS et al., 2004;

FERREIRA et al., 2005; MISRA et al., 2006; DOMINGUES et al., 2007) e

hepatomegalia com falha hepática fulminante (RIGAU-PÉREZ et al., 1998;

NOGUEIRA et al., 2002; LING; WILDER-SMITH; LEO, 2007) têm sido descritas com

relativa frequência. O atual diagnóstico de doença neurológica associada com

dengue é baseada no desenvolvimento de manifestações neurológicas em pacientes

com sorologia IgM positiva para dengue. Estas manifestações incluem síndrome de

Guillain-Barré (GBS), encefalite/encefalopatia, mielite, meningite, encefalomielite

aguda, polineuropatia, mononeuropatia facial e ulnar, além de hemorragias

cerebromeningeais (PATEY et al., 1993; SOLOMON et al., 2000; YAMAMOTO et al.,

2002; PALMA-DA-CUNHA-MATTA et al., 2004; CHOTMONGKOL et al., 2004;

PUCCIONI-SOHLER et al., 2009). A fisiopatologia do quadro neurológico na

infecção pelo DENV pode ser causada por fatores indiretos como edema cerebral,

hemorragia cerebral, falência hepatica fulminante com encefalopatia portosistêmica,

anóxia cerebral, hemorragia microcapilar e liberação de produtos tóxicos

(SUMARMO et al., 1983; LUM et al., 1996) ou estar diretamente relacionado com a

replicação viral no SNC causando meningites, encefalites, mononeuropatia e

polineneuropatias (BHOOPAT et al., 1996; MIAGOSTOVICH et al., 1997; RAMOS et

al., 1998).

Os casos que apresentam manifestações clínicas não usuais são atualmente

classificados pelo Ministério da Saúde do Brasil como dengue com complicações

(DCC) (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2005). A mudança do perfil clínico associado à

dengue pode ser devido a inúmeros fatores, incluindo a cepa do vírus infectante, o

estado imunológico do hospedeiro, ou ainda, o maior poder infectivo de mosquitos

vetores (RICO-HESSE et al., 1997; MANGADA; IGARASHI, 1998; LEITMEYER et

al., 1999, DUARTE DOS SANTOS et al., 2002). Provavelmente, tanto os fatores

virais como do hospedeiro devem contribuir para a gravidade da doença, porém a

importância de cada um permanece indeterminada.

Estratégias que visam avaliar a interação entre o vírus da dengue e as

células do hospedeiro têm sido utilizadas para uma melhor compreensão sobre os

processos de morfogênese e patogenicidade desses vírus.

1.6.1 Modelo murino no estudo da patogênese da dengue

A falta de um modelo animal apropriado que reflita as formas graves da

doença dificulta a caracterização de alguns aspectos envolvidos na patogênese da

dengue. Nos últimos anos, embora com limitações, o modelo de infecção em

camundongos vêm sendo caracterizado no estudo da patogênese do vírus da

dengue. Estes estudos incluem infecção por diferentes vias, infecção com cepas

neuroadaptadas em camundongos, linhagens de camundongos quiméricos

transplantados com células humanas e linhagens de camundongos knockout para

diversos genes (YAUCH; SHRESTA, 2008; WILLIAMS et al., 2009). Isolados clínicos

do DENV adaptados em cérebro de camundongos, apresentam aumento da

neurovirulência nestes animais (SABIN; SCHLESINGER, 1945; COLE; WISSEMAN,

1969) e atenuação em voluntários humanos (HOTTA, 1952; SABIN, 1952). Este

modelo foi predominantemente utilizado para testar a eficácia de vacinas de DENV

(KAUFMAN et al., 1987; BRAY et al., 1989; FALGOUT et al., 1990, VAN DER MOST

et al., 2000). Para se obter camundongos que pudessem ser inoculados via

periférica, e não pelo sistema nervoso central, foram desenvolvidas linhagens

quiméricas e imunocomprometidas, entre elas camundongos SCID, AG129, Balb/c,

A/J, entre outros (SHRESTA et al., 2006; YAUCH; SHRESTA, 2008; WILLIAMS et

al., 2009; RICO-HESSE, 2010). Em contrapartida, o uso de linhagens não

isogênicas, como linhagem Swiss, fornece um background imunológico heterogêneo

da população de camundongos (RICE; O’BRIEN, 1980; CUI; CHESSON; HOPE,

1993), o que reproduziria o cenário encontrado nas epidemias de dengue na

população.

Em 1998, Desprès et al., com o intuito de estudar alguns aspectos da

patogênese da dengue, estabeleceram um modelo murino de encefalite da dengue

através de passagens seriadas e alternadas do isolado clínico FGA/89 em cérebro

de camundongos Swiss e em células de linhagem AP61 (Aedes pseudocutellaris),

tentando mimetizar o ciclo de transmissão natural do vírus (Figura 1.11A). Após seis

passagens, duas variantes neurovirulentas foram geradas, denominadas FGA/NA-

d1d e FGA/NA-a5c, ambas causando encefalite fatal nos animais. Os genomas

dessas variantes, quando comparados com a cepa parental, apresentaram

substituições de aminoácidos nas proteínas E e NS3, implicando o aparecimento

dessas mutações no processo de neuroadaptação desses vírus (DESPRÈS et al.,

1998; DUARTE DOS SANTOS et al. 2000; BORDIGNON et al., 2007). Visando

confirmar estes achados, Bordignon et al. (2007) realizaram experimentos similares

através da passagem seriada da mesma cepa viral parental (FGA/89) em cérebro de

camundongos, porém, excluindo a etapa de infecção em culturas celulares (Figura

1.11B). Esse protocolo gerou a cepa neurovirulenta FGA/NA-P6 que, quando

comparada com a cepa parental, apresentou substituições de aminoácidos que,

embora não sendo idênticas àquelas previamente identificadas na cepa FGA/NA-

d1d, mapeavam nos mesmos domínios das proteínas E e NS3 (Quadro 1.1).

Quadro 1.1 – Substituições de aminoácidos identificadas nos genomas dos vírus neuroadaptados

FGA/NA-d1d e FGA/NA-P6, em comparação com a cepa parental FGA/89 e com o genoma do

clone infeccioso pBACDV1.

Figura 1.11 – Esquema da neuroadaptação da cepa FGA/89 em modelo murino. A. Geração da

cepa FGA/NA-d1d (DESPRÈS et al., 1998). B. Geração da cepa FGA/NA-P6 (BORDIGNON et al.,

2007).

As mutações identificadas em ambos os trabalhos parecem estar

relacionadas com o processo de neuroadaptação do DENV. Desta maneira, a

caracterização destes marcadores moleculares poderia contribuir para o

entendimento da patogênese da infecção pelo vírus da dengue, bem como, fornecer

subsídios que possam explicar o envolvimento do SNC em casos graves da doença.

1.7 Clones infecciosos e replicons como ferramentas genéticas

A tecnologia do DNA recombinante permite a análise e modificação

molecular de genomas, obtendo desta forma conhecimentos mais profundos em sua

organização e expressão. Os clones infecciosos de vírus RNA de polaridade positiva

são construções genéticas compostas pela sequência genômica completa do vírus

na forma de DNA. A inserção de sítios que permitem a transcrição in vitro ou in vivo,

possibilita a geração de uma molécula de RNA infecciosa que apresenta as mesmas

propriedades do RNA viral, sendo capaz de gerar partículas virais indistinguíveis de

vírus naturais (RICE et al., 1989; MEYERS; THIEL; RÜMENAPF, 1996; RUGGLI;

RICE, 1999; KUMMERER; RICE, 2002). A vantagem da obtenção de um clone a

partir de um genoma viral em um vetor é a sua fácil propagação em sistema

eucarioto e ampliação da progênie viral homogênea em cultura celular (RUGGLI;

RICE, 1999), diferentemente das amostras biológicas onde o RNA viral se apresenta

sob a forma de quasispecies (HOLMES, 2003; LIN et al., 2004). Clones infecciosos

são, portanto uma ferramenta indispensável para o estudo, por exemplo, do efeito de

mutações pontuais no genoma viral, funções biológicas do vírus, processamento da

poliproteína e virulência.

Uma alternativa aos clones infecciosos é a utilização de clones

subgenômicos, os replicons, que possuem todos os elementos necessários para

replicação do material genético em células, porém não possuem as sequências

codificadoras das proteínas estruturais e, portanto não são capazes de gerar novas

partículas virais (JONES; PATKAR; KUHN, 2005). Alguns autores demonstraram

que a omissão total da sequência das proteínas estruturais resulta na ausência de

replicação (KHROMYKH; WESTAWAY, 1997). É necessária a presença dos

nucleotídeos que codificam a porção N-terminal da proteína C, onde está localizada

a sequência 5’CS, que é complementar a sequência 3’CS da região 3’NTR (HAHN et

al., 1987), sendo essa complementaridade essencial para a replicação

(BREDENBEEK et al., 2003; LO et al., 2003; ALVAREZ et al., 2005a). Além disso, a

manutenção da sequência sinal da proteína NS1, codificada pela porção C-terminal

da proteína E, garante o correto endereçamento e processamento da mesma

(CHAMBERS et al., 1990; LINDENBACH; RICE, 2001). A maior vantagem dos

sistemas subgenômicos de replicons é o fato de permitirem análise de variáveis que

estão envolvidas no processo de replicação viral, pois isolam as proteínas não-

estruturais das estruturais que estão mais relacionadas aos processos de montagem

da partícula viral (KHROMYKH; WESTAWAY, 1997).

Já foram descritos clones infecciosos para vários vírus do gênero Flavivírus,

como YFV (RICE et al. 1989), os quatro sorotipos do vírus da dengue (LAI et al.,

1991; KAPOOR et al., 1995b; BLANEY JR et al., 2004a; SUZUKI et al., 2007), vírus

da encefalite japonesa (SUMIYOSHI; HOKE; TREND, 1992), vírus Kunjin

(KHROMYKH; WESTAWAY, 1994), vírus da encefalite transmitida por carrapatos

(GRITSUN; GOULD, 1995); vírus do Oeste do Nilo (YAMSHCHIKOV et al., 2001),

entre outros. Assim como os clones infecciosos, vários replicons também já foram

descritos, para vírus da dengue tipo 1, 2 e 3 (SUZUKI et al., 2007; PANG; ZHANG;

DAYTON, 2001; ALVAREZ et al., 2005a; JONES et al., 2005; HOLDEN et al., 2006;

NG et al., 2007, MOSIMANN et al., 2010), vírus da febre amarela (CORVER et al.,

2003; JONES; PATKAR; KUHN, 2005), vírus Kunjin (KHROMYKH; WESTAWAY,

1997), vírus da encefalite transmitida por carrapatos (GEHRKE et al., 2003), vírus da

Febre hemorrágica de Omsk (YOSHII; HOLBROOK, 2009), vírus da encefalite

japonesa (YUN et al., 2007) e vírus do Oeste do Nilo (YAMSHCHIKOV et al., 2001;

SHI; TILGNER; LO, 2002; SCHOLLE et al., 2004; ROSSI et al., 2005).

Os primeiros sistemas de clones infecciosos desenvolvidos para Flavivirus

foram para o vírus da febre amarela (RICE et al., 1989) e DENV4 (LAI et al., 1991).

A estratégia para contornar os problemas de instabilidade de clonagem do genoma

viral completo em um único plasmídeo de E.coli foi a utilização de dois plasmídeos

contendo fragmentos separados, seguido de ligação in vitro para gerar um molde

para a produção de RNAs sintéticos do genoma completo. Outras estratégias foram

desenvolvidas na tentativa de se propagar cDNAs do genoma inteiro, que pudessem

ser utilizados diretamente como moldes para a produção de RNAs infecciosos, como

o uso de plasmídeos de levedura (POLO et al., 1997; PURI et al., 2000), plasmídeos

de baixa cópia (GUALANO et al., 1998) e vetores de cromossomos artificiais de

bactérias (BAC) (VAN DER MOST; CORVER; STRAUSS,1999). A instabilidade de

alguns clones em sistemas bacterianos pode ser devido a potencial toxicidade de

alguns fragmentos dos genomas virais, porém não existem dados no caso de DENV

comprovando esta hipótese. (BOYER; HAENNI, 1994).

Com o uso da tecnologia de genomas infecciosos e replicons é possível

inserir uma ou um conjunto de mutações, para ensaiar o seu possível papel na

patogênese decorrente da infecção viral. Essas construções têm sido utilizadas para

avaliação de potenciais vacinas, como vetores para expressão de proteínas

heterólogas ou para se estudar o papel de mutações e deleções tanto nas proteínas

virais quanto nas regiões 5’NTR e 3’NTR do genoma (GUIRAKHOO et al., 2002,

2004, 2006; HUANG et al., 2003; MATEU et al., 2007; KINNEY et al., 1997;

GUALANO et al., 1998; CAMPBELL; PLETNEV, 2000; KÜMMERER; RICE, 2002;

HAYASAKA et al., 2004; SUZUKI et al., 2007; PLETNEV, 2001; SHI et al., 2002;

BREDENBEEK et al., 2003; YUN et al., 2003; TAJIMA et al., 2006; BONALDO et al.,

2007).

A grande maioria dos ensaios utilizando clones infecciosos no estudo de

marcadores de virulência para o vírus da dengue se restringe à porção estrutural do

vírus, ou ainda, utilizam clones quiméricos, onde as proteínas estruturais são

substituídas por proteínas similares de outros flavivirus (KAWANO et al.,1993;

CHEN et al.,1995; GUALANO et al.,1998; BRAY et al., 1998; WEI et al., 2003;

PURDY; CHANG, 2005; PIERRO et al., 2006; HSIEH et al., 2008).

2. JUSTIFICATIVA E OBJETIVOS

Doenças hemorrágicas virais são síndromes multi-sistêmicas caracterizadas

por dano vascular difuso e alteração na homeostase do sistema imunológico, que

frequentemente são acompanhadas por hemorragias. Os vírus geralmente

associados a essas síndromes são vírus que possuem envelope, de genoma RNA e

zoonóticos. Os quatro sorotipos da dengue podem causar desde uma febre

indiferenciada até casos mais graves, como o desenvolvimento de DHF e DSS,

devido ao extravasamento excessivo de plasma (HALSTEAD, 1988; GUBLER, 1994;

MONATH, 1994). Observações recentes indicam que as formas clínicas da doença

têm mudando e manifestações neurológicas são observadas frequentemente (LUM

et al., 1996; RAMOS et al., 1998; SOLOMON et al., 2000; CAM et al., 2001;

DOMINGUES et al., 2007). Os mecanismos precisos envolvidos no desenvolvimento

das formas graves e não-usuais da dengue ainda permanecem desconhecidos.

Estratégias genéticas que permitam caracterizar mecanismos moleculares

associados à virulência e a resposta do hospedeiro deverão contribuir para interferir

de forma controlada em etapas críticas durante a infecção viral. A tecnologia de

replicons/clones infecciosos se mostra bastante atraente para este propósito, pois

permite que mutações relacionadas a um determinado fenótipo viral possam ser

ensaiadas in vitro e in vivo. Em uma etapa mais avançada, essas construções

podem ser testadas quanto sua capacidade de replicação e/ou produção de

partículas virais na ausência e presença de potenciais inibidores.

Visando estudar a neuropatologia da dengue e mapear possíveis

marcadores moleculares de virulência, foram realizados estudos com cepas

neuroadaptadas em cérebro de camundongos, e algumas mutações, que poderiam

estar relacionadas com este fenótipo, foram identificadas (Quadro 1.1) (DESPRÈS et

al., 1998; DUARTE DOS SANTOS et al., 2000; BORDIGNON et al., 2007)

Para definir o envolvimento de cada uma destas substituições de

aminoácidos na aquisição do fenótipo de neurovirulência, o objetivo geral deste

trabalho foi gerar e caracterizar clones infecciosos contendo as mutações

identificadas, inseridas isoladamente ou em conjunto no genoma infeccioso

pBACDV1 da cepa viral DENV1 BR/90, previamente estabelecido (SUZUKI et al,

2007).

Os objetivos específicos foram:

• Amplificar os fragmentos contendo as mutaçõs de interesse e cloná-los no

contexto do genoma infeccioso de dengue sorotipo 1, pBACDV1;

• Transfectar os RNAs gerados por transcrição in vitro a partir dos clones

infecciosos mutados em células de inseto C6/36;

• Amplificar os estoques virais em culturas celulares de inseto C6/36;

• Determinar a sequência nucleotídica completa dos vírus amplificados em

culturas de células;

• Caracterizar os vírus recombinantes contendo as mutações de interesse

in vitro e in vivo.

• Analisar a modulação da expressão de alguns genes do hospedeiro em

resposta a infecção pelos vírus parental e neurovirulentos.

3. MATERIAIS E MÉTODOS

3.1. Construção de clones recombinantes

3.1.1 Amplificação dos fragmentos contendo as mutações de interesse

A amplificação das mutações em estudo, localizadas nas proteínas de

Envelope e não-estrutural NS3 (Quadro 1.1, item 1.6.1), foi realizada pela reação em

cadeia da polimerase (PCR - polymerase chain reaction) de fusão, utilizando como

molde o genoma viral do clone infeccioso pBACDV1. A amplificação dos fragmentos

consistiu em duas reações: na primeira reação eram amplificados dois fragmentos

(fragm A e fragm B) para cada mutação, e na segunda, também chamada PCR de

fusão, era feita a fusão dos dois fragmentos (fragm fusão – representação

esquemática na Figura 3.1) através da complementariedade das sequências dos

oligonucleotídeos iniciadores de polaridade negativa do fragm A e positiva do fragm

B, que continham a mutação (Quadro 3.1). Com exceção da mutação NS3-435, que

foi amplificada em uma única reação.

Os oligonucleotídeos iniciadores complementares de polaridade negativa do

fragm A e positiva do fragm B foram desenhados a fim de possuírem, além da

mutação de interesse, uma mutação silenciosa que modifica a sequência de um sítio

de enzima de restrição, o que facilita a triagem de possíveis clones em etapas

posteriores. Os sítios mutados foram: BstBI para E405, EcoRV para NS3-209 e

BsaBI para NS3-480. A mutação E402 já está localizada na sequência do sítio da

enzima BstBI, também podendo, portanto, ser utilizado na triagem dos clones. A

estratégia da mutação NS3-435 não possui outra mutação para triagem de clones.

As reações de PCR foram realizadas utilizando o kit comercial TripleMaster

System (Eppendorf), seguindo instruções do fabricante. A amplificação dos fragm A

e B foi submetida aos seguintes ciclos: 95ºC por 3 min., 25 ciclos de 95ºC por 30

seg., 50ºC por 30 seg. e 68ºC por 5 min., enquanto a amplificação do PCR de fusão

foi submetida a 95ºC por 3 min., 35 ciclos de 95ºC por 30 seg., 60-62ºC por 30 seg.

e 68ºC por 5 min. Alíquotas de 10% das reações de PCR foram visualizadas por

eletroforese em gel de agarose 0,8% contendo 0,5µg/mL de brometo de etídio.

Para a purificação, os amplicons foram excisados de géis de agarose e

purificados utilizando o kit comercial QIAquick Gel Extraction kit (QIAgen), seguindo

instruções do fabricante e recuperados em 50 a 100µL de tampão EB fornecido no

kit.

Quadro 3.1 – Oligonucleotídeos iniciadores utilizados para amplificação

dos fragmentos contendo as mutações de interesse para clonagem.

3.1.2 Clonagem dos fragmentos mutados em vetor pGEM-T Easy

Os fragmentos amplificados e purificados E-402, E-405 e NS3-435 que que se

mostraram de difícil clonagem em pBACDV1 (genoma infeccioso DENV1), foram

utilizados para clonagem em Sistema pGEM-T Easy (Promega) para posterior

transferência do fragmento para pBACDV1.

O pGEM-T Easy é um vetor de alta cópia, utilizado para clonagem direta de

produtos de PCR, preparado pela digestão com a enzima EcoRV e adição de uma

timidina em cada 3’ terminal. O vetor também contém promotor do bacteriófago T7 e

marcador de seleção para o antibiótico ampicilina (Figura 3.2). A reação de ligação

foi realizada seguindo recomendações do fabricante. A clonagem do inserto em

vetor pGEM-T Easy interrompe a sequência que codifica para o gene da !-

galactosidase. Clones recombinantes podem ser triados pelo sistema de "-

complementação, sendo identificados pela coloração das colônias bacterianas

quando crescidas em placas de cultura contendo agente indutor e seu substrato.

Figura 3.1 – Representação esquemática das etapas da amplificação dos fragmentos contendo as

mutações de interesse (fragm A, fragm B e fragm fusão) e as respectivas enzimas de restrição

utilizadas para cada estratégia de clonagem.

3.1.3 Preparo de células bacterianas de Escherichia coli (E.coli)

linhagens TOP10 e TOP10F’ cálcio competentes

Foi seguido o método de Mandel & Higa (1970). Estoques em glicerol das

linhagens TOP10 e TOP10F’, armazenados em N

líquido, foram estriados em

placas contendo meio Luria Broth (LB) sem antibiótico para TOP10 e LB contendo

12.5µg/mL de tetraciclina para TOP10F’, e incubados a 37°C por 16 horas. Uma

colônia bacteriana isolada de cada linhagem foi inoculada em 20 mL de meio líquido

LB1x sem antibiótico para TOP10 e LB1x contendo 12.5µg/mL de tetraciclina para

TOP10F’. A cultura foi incubada a 37°C por 16 horas sob agitação constante. O pré-

inóculo foi diluído 1:10 em 200mL de meio LB1x contendo o antibiótico apropriado.

As células foram incubadas a 37°C sob agitação constante até o início da fase de

crescimento exponencial atingindo uma absorbância entre 0.4 e 0.6 a 600nm. Após

20 min. no gelo, a cultura foi centrifugada a 4.000xg por 5 min. a 4°C (Centrífuga

Sorvall RC 5B Plus, rotor SLA 1500), o sobrenadante desprezado, e o sedimento

ressuspenso em metade do volume da cultura original (100mL) de uma solução

100mM CaCl

/10mM Hepes gelada e estéril. As células foram incubadas no gelo

durante 20 minutos. A suspensão foi submetida a uma centrifugação nas mesmas

condições anteriores. O sobrenadante foi descartado cuidadosamente e o sedimento

ressuspenso em 1/50 do volume da cultura original (4mL) da solução 100mM

CaCl

/10mM Hepes/10% glicerol gelada e estéril, incubado no gelo por 2 horas e

Figura 3.2 – Mapa do plasmídeo pGEM-T

Easy (Promega).

estocado em alíquotas de 100µL em tubos eppendorf a –70°C até a utilização.

Durante todo o procedimento as amostras eram mantidas em gelo.

3.1.4 Transformação de bactérias cálcio-competente TOP10F’ com

plasmídeos pGEM-T Easy

Para a transformação de bactérias competentes com as ligações inserto-vetor

pGEM-T Easy, células competentes TOP10F’ foram descongeladas em banho de

gelo (1 tubo com 100µL para cada transformação). Todo o volume das ligações era

adicionado diretamente nos tubos contendo as bactérias competentes, e esses eram

mantidos no gelo por 30 min. Em seguida era realizado choque térmico a 42ºC por 2

min., adicionados 900µL de meio SOC e os tubos incubados por 1 hora a 37ºC sob

agitação constante para a recuperação das células transformadas. Após este

período, alíquotas de 50µL e 100µL das bactérias transformadas foram semeadas

em placas contendo meio LB sólido suplementado com 100µg/mL de ampicilina,

0.4mM de IPTG (Isopropil-!-D-tiogalactopirosídeo) e 0.04mg/mL de X-gal (bromo-

chloro-indolyl-galactopyranosídeo) e incubadas a 30ºC por 16 horas. Colônias

brancas (recombinantes) foram transferidas para uma placa-mãe que consistia do

mesmo meio descrito acima, para a identificação de cada eventual clone através de

um papel quadriculado numerado colado no fundo. Cada clone candidato era

transferido da placa de crescimento para um quadrado numerado da placa-mãe com

o auxílio de um palito de dente e a placa era incubada a 30ºC, por 16 horas. Este

procedimento permite uma segunda seleção de colônias supostamente brancas e a

análise de possíveis colônias recombinantes de forma inequívoca.

3.1.5 Minipreparação do DNA plasmidial dos clones recombinantes em

pGEM-T Easy e sequenciamento

Após a triagem e identificação das colônias brancas na placa-mãe, algumas

colônias contendo os prováveis clones foram selecionadas e inoculadas em 3mL de

meio LB líquido suplementado com 100µg/mL de ampicilina e crescidas a 30ºC por

16 horas sob agitação constante. As culturas crescidas em meio líquido eram

sedimentadas por uma breve centrifugação para minipreparação dos plasmídeos

com o kit Wizard Plus SV Minipreps kit (Promega), de acordo com protocolo descrito

pelo fabricante. Todos os clones positivos foram estocados em glicerol 50% v/v, em

um volume total de 1mL, a –70ºC.

Para a confirmação da sequência nucleotídica dos clones recombinantes e

verificação de eventuais mutações indesejadas, os clones E402pGEM e NS3-

435pGEM foram sequenciados no Instituto Carlos Chagas (ICC) usando BigDye

Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems) em um ABI PRISM 3100

Genetic Analyzer (Applied Biosystems), e os clones E405pGEM foram enviados para

sequenciamento na Macrogen (Seoul, Coréia do Sul) (Quadro 3.2).

3.1.6 Minipreparação do genoma infeccioso pBACDV1

O genoma infeccioso pBACDV1 (SUZUKI et al., 2007) foi construído em um

cromossomo artificial de bactéria (BAC), vetor de cópia única, e contém o genoma

completo do vírus da dengue tipo 1, cepa BR/90 (número de acesso GenBank

AF226685), a sequência do promotor da T7 RNA polimerase (T7 prom) adicionado

de uma base G, imediatamente antes do primeiro nucleotídeo do genoma viral e, a

sequência da ribozima do vírus da hepatite delta (HDV-RZ), o sítio de terminação da

T7 RNA polimerase (T7 term) e o sítio de restrição SwaI, imediatamente após o

término do genoma viral. O vetor ainda possui marcador de seleção para o

antibiótico cloranfenicol, origem de replicação OriS e fator de fertilidade F de E. coli

(Figura 3.3).

Quadro 3.2 – Oligonucleotídeos iniciadores utilizados para sequenciamento dos possíveis

clones recombinantes clonados em pGEM-T Easy.

Estoques em glicerol do genoma infeccioso pBACDV1 foram inoculados em

20mL de meio Terrific Broth (TB) líquido suplementado com 15µg/mL de

cloranfenicol e cultivados a 30ºC por 16 horas sob agitação constante. As culturas

crescidas em meio líquido eram sedimentadas por uma breve centrifugação para

minipreparação dos plasmídeos com o kit Wizard Plus SV Minipreps kit (Promega),

de acordo com protocolo descrito pelo fabricante. Os DNAs eram recuperados em

50µL de água livre de nucleases fornecida no kit.

3.1.7 Sub-clonagem em pBACDV1 – clones com mutação única

O genoma infeccioso pBACDV1, os fragmentos de PCR purificados e os

clones pGEM confirmados por sequenciamento foram digeridos para sub-clonagem

utilizando diferentes estratégias para cada mutação.

• E402 e E405: O pBACDV1 e os clones E402pGEM e E405pGEM foram tratados

com as enzimas de restrição NotI 10U/µL e MluI 10U/µL (New England Biolabs),

de acordo com os tampões e condições descritas pelo fabricante das enzimas.

Os fragmentos gerados estão representados na Figura 3.4.

Figura 3.3 – Representação esquemática do mapa do genoma

infeccioso pBACDV1.

• NS3-209: O vetor pBACDV1 e o fragmento NS3-209, amplificado e purificado,

foram digeridos com as enzimas MluI 10U/µL e BsiWI 10U/µL (New England

Biolabs), de acordo com os tampões e condições descritas pelo fabricante das

enzimas. Os fragmentos gerados estão representados na Figura 3.5.

• NS3-435: O genoma infeccioso pBACDV1 e o clone NS3-435-pGEM foram

digeridos com as enzimas BsiWI 10U/µL e RsrII 5U/µL (New England Biolabs), de

Figura 3.4 – Representação esquemática da digestão dos clones pBACDV1 e E402-pGEM ou E405-

pGEM (Emut-pGEM) com as enzimas de restrição NotI e MluI. Em A e C, a representação do mapa

dos plasmídeos, destacando a localização dos sítios das enzimas (setas vermelhas), em B e D, o

perfil dos fragmentos gerados pela digestão, destacando os fragmentos a serem utilizados (setas

azuis).

Figura 3.5 – Representação esquemática da digestão do clone pBACDV1 e do fragmento de PCR

NS3-209 com as enzimas de restrição MluI e BsiWI. Em A e C, a representação do mapa do

plasmídeo e do PCR, destacando a localização dos sítios das enzimas (setas vermelhas), em B e D,

o perfil dos fragmentos gerados pela digestão, destacando os fragmentos a serem utilizados (setas

azuis).

acordo com os tampões e condições descritas pelo fabricante das enzimas. Os

fragmentos gerados estão representados na Figura 3.6.

• NS3-480: O vetor pBACDV1 e o fragmento NS3-480, amplificado e purificado,

foram tratados com as enzimas BsiWI 10U/µL e NheI 10U/µL (New England

Biolabs), de acordo com os tampões e condições descritas pelo fabricante das

enzimas. Os fragmentos gerados estão representados na Figura 3.7.

Figura 3.6 – Representação esquemática da digestão dos clones pBACDV1 e NS3-435-pGEM

com as enzimas de restrição BsiWI e RsrII. Em A e C, a representação do mapa dos plasmídeos,

destacando a localização dos sítios das enzimas (setas vermelhas), em B e D, o perfil dos

fragmentos gerados pela digestão, destacando os fragmentos a serem utilizados (setas azuis).

Figura 3.7 – Representação esquemática da digestão do clone pBACDV1 e do fragmento de

PCR NS3-480 com as enzimas de restrição BsiWI e NheI. Em A e C, a representação do mapa

do plasmídeo e do PCR, destacando a localização dos sítios das enzimas (setas vermelhas), em

B e D, o perfil dos fragmentos gerados pela digestão, destacando os fragmentos a serem

utilizados (setas azuis).

A substituição dos fragmentos liberados do genoma infeccioso pBACDV1 foi

realizada pela ligação dos respectivos fragmentos mutados, seguindo o protocolo da

enzima T4 DNA ligase (New England Biolabs ou USB), para um volume final de

reação de 15µL. As reações foram incubadas a 16ºC ou 4ºC por 16 horas. As

quantidades de DNA, necessárias para as reações de ligação entre o vetor

pBACDV1 e os insertos, foram determinadas visualmente por eletroforeses em gel

de agarose ou pela sua dosagem utilizando espectrofotômetro (Nanodrop –

Thermo). Foi utilizada uma relação de 3:1 (inserto:vetor), de acordo com a fórmula

representada no quadro abaixo.

3.1.8 Transformação de bactérias cálcio-competente TOP10 com

plasmídeos pBACDV1

Células bacterianas TOP10 foram transformadas com todo o volume da

ligação e incubadas por 30 min. no gelo. Em seguida eram submetidas a um choque

térmico a 42°C por 40 seg., adicionados 250µL de meio SOC e as células incubadas

a 37ºC por 1 h. sob agitação constante para sua recuperação. Após esse período,

todo o volume das bactérias transformadas eram semeadas em placas contendo

meio TB sólido contendo 15µg/mL de cloranfenicol e incubadas a 30°C por 16 a 48h.

Após a verificação da presença de possíveis colônias recombinantes na placa, era

feita uma placa mãe para a identificação de cada eventual clone, como já descrito no

item 3.1.4.

3.1.9 Seleção de clones recombinantes pela técnica de PCR de colônia e

confirmação por digestão

As colônias obtidas a partir da ligação com vetor pBACDV1 foram triadas pela

técnica de PCR de colônia. Cada colônia era passada da placa mãe, com auxílio de

um palito de dente estéril, para um tubo eppendorf (identificado com o número

correspondente) contendo 10µL de água ultrapura e cada tubo era incubado a 98ºC

por 5 minutos. Em seguida, os tubos eram centrifugados a 16000xg por 30 seg. e

1µL do sobrenadante era utilizado na reação de PCR, utilizando o kit Taq DNA

Polimerase (5U/µL, Invitrogen). Os oligonucleotídeos utilizados para amplificação

das regiões mutadas estão contidos na Quadro 3.3. A reação era submetida a um

ciclo a 94ºC por 3 min. e a 35 ciclos a 94ºC por 30 seg., 52ºC por 30 seg. e 72ºC por

1 min. Alíquotas das amostras de DNA amplificadas (1:10) foram analisadas por

eletroforese em gel de agarose 0,8% contendo 0.5µg/mL de brometo de etídio.

Os fragmentos que apresentavam amplificação positiva eram, então,

confirmados pela digestão com a enzima de restrição que reconhece o sítio mutado

silenciosamente, de acordo com cada estratégia. Os sítios mutados para

confirmação dos clones são: BstBI para E-402 e E-405, EcoRV para NS3-209 e

BsaBI para NS3-480 (Quadro 3.3). A estratégia da mutação NS3-435 não possui

modificações para triagem de clones.

Quadro 3.3 – Oligonucleotídeos iniciadores utilizados para amplificação por PCR de colônia e

enzimas de restrição utilizadas para digestão dos PCRs, para confirmação de clones.

As digestões foram realizadas de acordo com o protocolo do fabricante

(Biolabs) e incubadas por 1h 30 min. em sua temperatura ideal. Os clones positivos

eram identificados pela não clivagem do sítio de restrição.

3.1.10 Minipreparação dos clones recombinantes pBACDV1-mut e

sequenciamento

As colônias dos clones confirmados por digestão foram inoculadas em 20mL

de meio TB líquido suplementado com 15µg/mL de cloranfenicol e crescidos a 30ºC

por 16 horas sob agitação constante. As culturas foram utilizadas para

minipreparação de DNA, como já descrito anteriormente no item 3.1.6.

Como a clonagem é feita em vetor BAC, para a confirmação da sequência

nucleotídica por sequenciamento, fez-se necessária a amplificação das regiões de

interesse com enzima de alta fidelidade para um melhor resultado e qualidade da

região sequenciada. Para tanto, foi feita a amplificação por PCR das regiões que

abrangiam os fragmentos substituídos (Tabela 3.4), utilizando os kits comerciais

TripleMaster System (Eppendorf) ou LongRange PCR (QIAgen), seguindo instruções

dos fabricantes, e foram submetidas aos seguintes ciclos: 93ºC por 3 min., 40 ciclos

de 93ºC por 30 seg., 52ºC por 30 seg. e 68ºC por 4 min. Alíquotas de 10% da reação

de PCR foram visualizadas por eletroforese em gel de agarose 0,8% contendo

0,5µg/mL de brometo de etídio. Para a purificação, os amplicons foram excisados de

géis de agarose e purificados utilizando o kit comercial QIAquick Gel Extraction kit

(QIAgen), seguindo instruções do fabricante e recuperados em 30µL de tampão EB

fornecido no kit. Os clones E-402, NS3-209 e NS3-480 foram sequenciados no

Instituto Carlos Chagas (ICC) usando BigDye Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit

(Applied Biosystems) em um ABI PRISM 3100 Genetic Analyzer (Applied

Biosystems). Os demais clones foram enviados para sequenciamento na Macrogen

(Seoul, Coréia do Sul) (Quadro 3.5).

Quadro 3.4 – Oligonucleotídeos iniciadores utilizados para amplificação de PCR dos possíveis

clones recombinantes clonados em pBAC.

Quadro 3.5 – Oligonucleotídeos iniciadores utilizados para sequenciamento dos PCR dos

possíveis clones recombinantes clonados em pBAC.

3.1.11 Construção de clones recombinantes – duplos e triplo mutantes

Os clones duplos e triplo mutantes foram construídos com a combinação das

mutações localizadas nas proteínas E e NS3, de cada vírus neuroadaptado (Quadro

1.1, item 1.5.1). A construção foi feita a partir dos clones contendo uma única

mutação, confirmados por sequenciamento, onde foi clonada a segunda mutação. A

substituição do novo fragmento mutado foi feita com os fragmentos liberados dos

clones em pGEM-T Easy ou dos clones em pBACDV1 com sua sequência

confirmada.

Para tanto, foram construídos os seguintes clones:

• E405/NS3-435: contém as duas mutações do vírus FGA/NA-d1d, e foi construído

pela inserção do fragmento NS3-435, liberado do clone em NS3-435pGEM, no

clone E405pBAC, que foram digeridos com as enzimas BsiWI 10U/µL e RsrII

5U/µL (New England Biolabs), de acordo com os tampões e condições descritas

pelo fabricante das enzimas.

• E402/NS3-209: contém a combinação de duas mutações do vírus FGA/NA-P6, e

foi construído pela inserção do fragmento mutado NS3-209, liberado do clone em

NS3-209pBAC, no clone E402pBAC, que foram digeridos com as enzimas MluI

10U/µL e BsiWI 10U/µL (New England Biolabs), de acordo com os tampões e

condições descritas pelo fabricante das enzimas.

• E402/NS3-480: contém a combinação de duas mutações do vírus FGA/NA-P6, e

foi construído pela inserção do fragmento mutado NS3-480, liberado do clone em

NS3-480pBAC, no clone E402pBAC, que foram digeridos com as enzimas BsiWI

10U/µL e NheI 10U/µL (New England Biolabs), de acordo com os tampões e

condições descritas pelo fabricante das enzimas.

• E402/NS3-209/NS3-480: contém as a combinação das três mutações

encontradas no vírus FGA/NA-P6, e foi construído pela inserção do fragmento

mutado NS3-480, amplificado por PCR de fusão, no clone E402/NS3-209, que

foram digeridos com as enzimas BsiWI 10U/µL e NheI 10U/µL (New England

Biolabs), de acordo com os tampões e condições descritas pelo fabricante das

enzimas.

Os novos clones recombinantes, duplos e triplo mutantes, seguiram os

mesmos protocolos e condições dos clones contendo uma única mutação para

construção, confirmação de clones (Quadro 3.6) , sequenciamento, amplificação e

análise dos vírus recombinantes.

3.2. Geração de vírus recombinantes

3.2.1 Linearização dos clones recombinantes por digestão

Um clone de cada estratégia de construção, todos confirmados por

sequenciamento, foram selecionados para prosseguir para as próximas etapas.

As minipreparações foram linearizadas pela digestão com a enzima de

restrição SwaI 10U/µL, de acordo com os tampões e condições descritas pelo

fabricante das enzimas. A reação foi incubada a 25°C por 16 horas. O fragmento

gerado está representado na Figura 3.8.

Quadro 3.6 – Oligonucleotídeos iniciadores utilizados para amplificação dos PCR dos

possíveis clones, duplos e triplo mutante, para confirmação por sequenciamento.

A purificação da digestão foi feita com reagentes livres de nucleases, e foram

adicionados 12µL 1M NaCl, 1µL SDS10%, 2µL 0.5M EDTA e 1µL de glicogênio de

ostra (10mg/mL) em cada tubo. As amostras foram extraídas com

fenol/clorofórmio/álcool isoamílico e a mistura foi precipitada com 3 volumes de

etanol absoluto, a –20°C por 16 horas. Após este período, o material foi centrifugado

a 16.000xg por 15 min. a 4°C, lavado com etanol 70% e centrifugado novamente por

10 min. O DNA foi recuperado em 5µL de água livre de nucleases, fornecida no kit

de transcrição in vitro.

3.2.2 Transcrição in vitro

O DNA linearizado e purificado foi utilizado como molde para a reação de

transcrição in vitro, utilizando o kit comercial T7 MEGAscript High Yield Transcription

(AMBION). A reação foi composta por 2,5µL do DNA linearizado e purificado, 1µL de

tampão de reação 10x, 1µL de ATP, 1µL de CTP, 1µL de UTP, 0,5µL de GTP, 1µL

de m

G(5')ppp(5')G RNA Cap Structure Analog (New England Biolabs), 1µL de água

livre de nucleases e 1µL de T7 RNA polimerase, e foi incubada a 38°C por 3 horas.

Alíquotas de 5% da reação de transcrição foram visualizadas por eletroforese

em gel de agarose 0,8% contendo 0,5µg/mL de brometo de etídio, livres de

nucleases.

Figura 3.8 – Representação esquemática da digestão do clone pBACDV1 com

enzimas de restrição SwaI. Em A, a representação do mapa do plasmídeo, destacando

a localização do sítio da enzima (seta vermelha), em B, o perfil do fragmento gerado

pela digestão, apontado pela seta azul.

3.2.3 Determinação da linhagem celular e método de transfecção

Para determinar a melhor linhagem celular para o estudo, células de inseto

C6/36 (glândula salivar de mosquito Aedes albopictus) e células de mamífero BHK-

21 (baby hamster kidney) foram testadas em diferentes condições de transfecção. O

método de transfecção do RNA também foi avaliado quanto à sua eficácia e

rendimento. Foram testados os protocolos de eletroporação e transfecção por

lipossomos.

3.2.3.1 Eletroporação

Culturas de células C6/36 e BHK-21 com 60% de confluência em garrafa

T150 (TPP) foram utilizadas para o teste de eletroporação. As monocamadas de

células foram destacadas das garrafas, por raspagem física para C6/36 e pela ação

da tripsina para BHK-21, centrifugadas a 4°C e lavadas com 1xPBS gelado, por três

vezes. As células eram contadas em câmara de Neubauer e recuperadas em 1xPBS

gelado para 2x10

células/mL. Uma quantidade de 8x10

células foi eletroporada

com o RNA do clone pBACDV1, nas seguintes condições: 2 pulsos de 750V,

capacitância 25µF e resistência !. Após o choque, as células foram incubadas por 5

min. a temperatura ambiente e, em seguida, adicionadas a 10mL de meio de cultura

específico e distribuídas em placas de 4 poços (TPP). As placas foram incubadas

por 4 horas e o meio substituído em seguida. Os sobrenadantes foram recolhidos

nos tempos de 48, 72, 96 e 120 horas pós eletroporação, aliquotados e

armazenados a –70°C para posterior titulação.

3.2.3.2 Transfecção por lipossomos

Células C6/36 (1x10

células/poço) e BHK-21 (5x10

células/poço) foram

semeadas em placas de 4 poços (TPP) para transfecção do RNA pBACDV1. Foram

utilizadas 2,5µg de lipofectina (Invitrogen) para cada poço, que era misturada com

meio OptiMEM (GIBCO/Invitrogen) e incubada a temperatura ambiente por 30 min.

As células foram lavadas uma vez com 1mL de OptiMEM e os RNAs misturados com

o mesmo meio, em um novo tubo mantido em gelo. O meio das células era então

removido, a mistura meio/lipofectina era distribuída nos tubos contendo RNA/meio e

a combinação lipofectina/RNA/meio era adicionada aos poços contendo as células.

As placas foram incubadas a 28°C (para C6/36) e 37°C (para BHK), por 3 horas para

adsorção do RNA. Após este período, o inóculo foi substituído por 1,5mL de meio

correspondente, e a cultura mantida em temperatura adequada até o momento de

seu recolhimento. Os sobrenadantes foram recolhidos nos tempos de 48, 72, 96 e

120 horas pós-transfecção, aliquotados e armazenados a –70°C para posterior

titulação.

3.2.4 Transfecção de RNA recombinante em células de inseto C6/36

A metodologia escolhida para a transfecção dos RNAs foi o protocolo por

lipossomos. Os RNAs recombinantes resultantes das transcrições in vitro (item

3.2.2) foram utilizados para transfectar células de inseto C6/36, utilizando o protocolo

da lipofectina, como descrito acima (item 3.2.3.2).

3.2.5 Titulação viral por imunodetecção de foco

A presença de partículas virais no sobrenadante das transfecções foi avaliada

através da técnica de titulação viral por imunodetecção de foco. Foi utilizada uma

quantidade de 1x10

células C6/36 por poço, semeadas em placas de 24 poços

(TPP). As células eram infectadas com 400µL de diluições seriadas (1:10) dos

sobrenadantes em meio L15 (Leibovitz L-15) suplementado com 0,26% de triptose

(Sigma) e 25µg/mL de solução de gentamicina (GIBCO/Invitrogen), denominado L15

sem soro. O inóculo foi incubado, em duplicata, com as células por 1h a 28°C e, em

seguida, substituído por uma mistura (1:2) de meio de cultura L15 completo

suplementado com 10% de SFB e solução 3,2% Carboxi Metil Celulose (CMC)

(Sigma). As placas eram seladas com fita e incubadas em estufa a 28°C por 7 dias.

Para a revelação dos focos de infecção, as células foram lavadas com solução

1xPBS para a completa remoção do CMC, fixadas com solução 3% paraformaldeído

(Sigma) por 20 min. a temperatura ambiente, permeabilizadas com 0,5% Triton X-

100 (Sigma) por 4 min. a temperatura ambiente, lavadas três vezes com solução

1xPBS e incubadas com anticorpo monoclonal anti-E, 4G2 flavivirus-específico,

diluído 1:200 em solução 1xPBS, por 1h a 37ºC. Em seguida, as células foram

lavadas novamente com 1xPBS e incubadas com anticorpo anti-IgG de camundongo

conjugado com fosfatase alcalina (Promega), diluído 1:10.000 em solução 1xPBS

por 1 hora a 37ºC. Após a reação com o anticorpo secundário, as células foram

novamente lavadas com 1xPBS e a reação foi revelada pela adição dos substratos

da enzima (BCIP e NBT, 50mg/mL, Promega) diluídos em tampão fosfatase alcalina

(AP buffer), por 30 min. sob agitação leve e constante, a temperatura ambiente e ao

abrigo da luz. O título viral é expresso em unidades formadoras de foco por mL

(ffu/mL) que é determinado pela fórmula abaixo:

3.2.6 Amplificação de estoques virais em cultura de células de inseto

A fim de amplificar o estoque viral das amostras transfectadas, gerando

quantidades suficientes de vírus de mesmo lote para utilização em todos os

experimentos subsequentes, foram feitas duas passagens subsequentes em células

de inseto (C6/36), a partir do sobrenadante recolhido após a transfecção.

Para essas passagens, células C6/36 foram infectadas com esses

sobrenadantes em uma multiplicidade de infecção (MOI) de 0.01. O inóculo foi

incubado com as células por 1h a 28°C e, em seguida, substituído por meio L15

completo. As infecções eram acompanhadas por 5 a 7 dias, até o aparecimento de

efeito citopático. As culturas eram recuperadas por raspagem, transferidas para

tubos e centrifugadas a 480xg, por 10 min., a 4°C em centrífuga Sorvall Super T21.

Os sedimentos de células eram então separados dos sobrenadantes, que eram

aliquotados em tubos de 1.5mL, no caso da primeira passagem, ou utilizados para

purificação dos vírus por gradiente de sacarose, no caso da segunda passagem.

Todo o material era estocado a –70°C e a presença de partículas virais nos

sobrenadantes foi avaliada através da técnica de titulação viral por imunodetecção

de foco, exatamente como descrito no item 3.2.5.

3.2.7 Purificação viral em gradiente de sacarose

A fim de se obter estoques virais purificados e concentrados, os

sobrenadantes das culturas da segunda passagem foram precipitados com 7% de

polietileno glicol (PEG P.M. 8.000) e 2,3% NaCl, sob agitação leve e constante, por

16 horas a 4ºC. Após este período, as culturas precipitadas foram centrifugadas a

12.000xg, por 30 min., a 4ºC em centrífuga Sorvall Super T21. Os sedimentos

contendo as partículas virais foram ressuspensos em 3mL de tampão TNE (50mM

Tris (pH7.5), 100mM NaCl, 1mM EDTA) e adicionados sobre gradientes

descontínuos de sacarose 60% e 30% (preparada no mesmo tampão). O material foi

centrifugado em ultracentrífuga (Itachi) a 250.000xg, por 2 a 3 horas. Após a

ultracentrifugação, as bandas contendo os vírus concentrados eram visualizadas

com o auxílio de um anteparo escuro, coletadas com pipetas Pasteur descartáveis,

aliquotadas e armazenadas a –70ºC. A quantificação das partículas virais nos

sobrenadantes precipitados e purificados foi avaliada através da técnica de titulação

viral por imunodetecção de foco, exatamente como descrito no item 3.2.5.

É importante ressaltar que o genoma infeccioso, pBACDV1, e o controle

negativo, mock, foram igualmente processados com os mesmos critérios de

passagem em cultura de células e purificação por gradiente de sacarose, e foram

utilizados como parâmetros de controle nos experimentos de infecção celular e

posteriormente, nos experimentos de inoculação em camundongos, para assegurar

a infectividade e letalidade dos vírus recombinantes.

3.2.8 Sequenciamento completo dos vírus recombinantes

Para a confirmação da sequência nucleotídica completa dos vírus

recombinantes amplificados e concentrados, 100µL de vírus purificado por gradiente

foram utilizados para extração de RNA utilizando o kit comercial QIAamp Viral RNA

Mini Kit (QIAgen), seguindo recomendações do fabricante, e eluídos em 60µL de

tampão AVE fornecido pelo kit.

O RNA viral foi convertido em cópia complementar de DNA (cDNA) utilizando

o kit Improm II Reverse Transcriptase (Promega) e o oligonucleotídeo iniciador

Random Primer (100pmol/µL – Invitrogen), seguindo especificações do kit.

Os cDNAs foram utilizados como molde para amplificação, por PCR, de seis

ou sete fragmentos que cobriam o genoma inteiro do vírus, utilizando

oligonucleotídeos iniciadores específicos (Quadro 3.7).

Quadro 3.7 – Oligonucleotídeos iniciadores utilizados para amplificação por PCR do genoma

completo dos clones a partir do RNA dos vírus purificados por gradiente de sacarose.

As reações de PCR foram realizadas utilizando o kit comercial LongRange

PCR (QIAgen), seguindo instruções do fabricante, e foram submetidas aos seguintes

ciclos: 93ºC por 5 min., 40 ciclos de 93ºC por 30 seg., 52ºC por 30 seg. e 68ºC por 4

min. Alíquotas de 10% da reação de PCR foram visualizadas por eletroforese em gel

de agarose 0,8% contendo 0,5µg/mL de brometo de etídio. Para a purificação, os

amplicons foram excisados de géis de agarose e purificados utilizando o kit

comercial QIAquick Gel Extraction kit (QIAgen), seguindo instruções do fabricante e

recuperados em 30 a 60µL de tampão EB fornecido no kit.

Os fragmentos e os oligonucleotídeos iniciadores específicos (Quadro 3.8)

foram enviados para sequenciamento na Macrogen (Seoul, Coréia do Sul). As

seqüências nucleotídicas foram analisadas através do pacote de programas

Phred/Phrap/Consed (www.phrap.org). O software CLUSTALx (HIGGINS; SHARP,

1988) foi utilizado para alinhar as sequências e o software GENEDOC (NICHOLAS;

NICHOLAS JR; DEERFIELD, 1997) para visualizar as diferenças de nucleotídeos e

aminoácidos entre os vírus mutados.

Quadro 3.8 – Oligonucleotídeos iniciadores utilizados para sequenciamento do genoma

completo dos clones a partir das amplificações por PCRs dos vírus purificados em gradiente

de sacarose.

3.3. Análise in vitro dos vírus recombinantes

3.3.1 Análise comparativa do efeito citopático dos vírus recombinantes e

controles em cultura de células de inseto C6/36

Para a análise do efeito citopático dos vírus recombinantes, foi utilizada uma

quantidade de 5x10

células C6/36, semeadas em uma garrafa T25 (TPP) por

amostra. As células eram infectadas com MOI de 0.01 dos sobrenadantes

purificados por gradiente de sacarose, diluídos em meio L15 sem soro para volume

final de 1mL. Para uma análise comparativa, além dos vírus recombinantes, foram

realizadas infecções em paralelo com vírus gerados a partir do genoma infeccioso

pBACDV1, os vírus neuroadaptados FGA/NA-d1d e FGA/NA-P6 e o controle

negativo (mock). O inóculo foi incubado com as células por 1h a 28°C e, em seguida,

substituído por 5mL de meio L15 completo. As infecções eram acompanhadas por

até 7 dpi e o efeito citopático era observado nos dias 5, 6 e 7 dpi, com microscópio

invertido Nikon Eclipse TE300 e fotografado para registro.

3.3.2 Imunofluorescência indireta de cultura de células de inseto C6/36

com os vírus recombinantes e controles

Para a análise comparativa da infecção com os vírus recombinantes por

imunofluorescência, foi utilizada uma quantidade de 1x10

células C6/36, semeadas

em quatro placas de 24 poços (TPP). A monocamada de células era infectada com

MOI de 0.01 dos sobrenadantes purificados por gradiente de sacarose, diluídos em

meio L15 sem soro para volume final de 500µL por poço. Para uma análise

comparativa, além dos vírus recombinantes, foram realizadas infecções em paralelo

com vírus gerados a partir do genoma infeccioso pBACDV1 e o controle negativo

(mock). O inóculo foi incubado em duplicata com as células por 1h a 28°C e, em

seguida, substituído por 1,5mL de meio L15 completo. As placas eram seladas com

fita e incubadas em estufa a 28°C por 5 e 7 dias.

Para a reação de imunofluorescência, duas placas foram fixadas com 5 dpi e,

outras duas, com 7dpi. Os sobrenadantes foram retirados e descartados, e as

células fixadas em solução acetona/metanol (1:1) por 1 hora e meia, a –20°C. Após

este período, a solução de fixação era descartada e uma placa era reagida com

anticorpo monoclonal anti-E, 4G2 flavivirus-específico, diluído 1:100 em solução

1xPBS, e outra placa, com sobrenadante de cultura de um hibridoma secretor de

anticorpo monoclonal anti-helicase DENV1, 1402-7B. As placas eram incubadas a

37ºC por 1h. Em seguida, as células foram lavadas novamente com 1xPBS e

incubadas com anticorpo anti-IgG de camundongo conjugado com FITC (Gibco-

BRL), diluído 1:300 em solução 1xPBS contendo 3µL/mL de Azul de Evans 1%, por

1 hora a 37ºC. Após a reação com o anticorpo secundário, as células foram

novamente lavadas com 1xPBS e incubadas com DAPI (Sigma), diluído 1:2.000 em

solução 1xPBS, por 5 min., a temperatura ambiente e ao abrigo da luz. As células

foram, então, abundantemente lavadas com 1xPBS, a solução de lavagem foi

completamente evaporada e foram adicionados 200µL de solução 1xPBS contendo

10% glicerol para proceder a visualização e fotodocumentação com microscópio

invertido de fluorescência Nikon Eclipse TE300.

3.4. Análise in vivo dos vírus recombinantes

3.4.1 Inoculação de camundongos – ensaio de DL

do genoma

infeccioso pBACDV1 e infecção com vírus recombinantes e controles

Os vírus recombinantes purificados por gradiente de sacarose foram

utilizados para inoculação via intracerebral (i.c.) (GOULD; CLEGG, 1985) em

camundongos Swiss neonatos (até 48h após o nascimento). A dose viral

estabelecida para inoculação com os vírus recombinantes foi 10

-2

ffu (dois logs a

menos) de 50% da dose letal (DL

) (DESPRÈS et al. 1998). Para determinar essa

dose foi utilizado o vírus gerado a partir do genoma infeccioso pBACDV1. Quatro

grupos de animais (entre 7 e 10 filhotes) foram inoculados com as doses de 10

, 10

e 10

ffu e um grupo de animais (10 filhotes) foi inoculado com o controle

negativo, mock. Os animais foram acompanhados por 21 dias para observação de

morbidade e mortalidade. A dose viral correspondente a DL

foi estabelecida

através de cálculo, conforme fórmula abaixo, baseando-se nos resultados de

mortalidade obtidos para as diferentes doses testadas.

Cada vírus recombinante, o vírus parental (gerado a partir do genoma

infeccioso pBACDV1), o mock e os vírus neuroadaptados FGA/NA-d1d e FGA/NA-

P6, todos purificados em gradiente de sacarose, foram diluídos em meio de cultura

celular L15 sem soro para uma concentração de 1x10

2,75

ffu e inoculados via i.c. em

grupos de camundongos neonatos (40µL por animal). Todos os inóculos foram feitos

em triplicata e os animais foram observados por 21 dias para análise do

aparecimento dos sinais de encefalite e morte. Oito dias pós-inoculação (dpi), três

animais de cada grupo eram sacrificados por anóxia, utilizando CO

, para a coleta

do tecido cerebral. Os tecidos cerebrais dos animais sacrificados (pool de três

animais) foram homogeneizados, pesados e utilizados para a extração do RNA viral.

Outro animal de cada grupo foi sacrificado no décimo dpi, da mesma maneira

descrita anteriormente, e os tecidos cerebrais foram fixados em solução de 10%

formalina e utilizados para ensaios de histopatologia.

Todo o manejo dos animais infectados foi realizado em câmara de segurança

nível 2. Os animais eram mantidos em gaiolas isoladas com filtros de ar, com

comida, água ad libitum e ciclo claro-escuro de 12 horas. As gaiolas eram forradas

de cepilho, sendo a troca de cama e a higienização das caixas realizadas duas

vezes por semana. Os camundongos eram sacrificados, utilizando-se câmara de

. Os experimentos com animais foram aprovados pelo comitê de ética em

experimentação animal da Universidade Federal do Paraná (CEP/UFPR 23075-

0429663/2007-97).

3.4.2 Extração RNA de tecido cerebral infectado com vírus

recombinantes e controles

O RNA total foi extraído a partir de 30mg de tecido cerebral macerado de um

pool de três camundongos 8 dpi, utilizando o kit comercial RNeasy Mini Kit

(QIAGEN), de acordo com as instruções do fabricante, eluído em 60µL de tampão

de eluição fornecido pelo kit e mantido a –70ºC.

3.4.3 Avaliação de possível contaminação com vírus da encefalomielite

murina de Theiler no sistema nervoso central de camundongos por PCR em

tempo real

O vírus da encefalomielite murina de Theiler (TMEV) é um patógeno entérico

de camundongos, pertencente ao gênero Cardiovirus da família Picornaviridae

(RUECKERT, 1996), que possui cepas neurovirulentas (GDVII e FA) que induzem

uma encefalite aguda e fatal, e cepas de baixa virulência (TO, WW, DA e BeAn) que

persistem no sistema nervoso central, induzindo doença crônica, caracterizada por

desmielinização (LIPTON, 1975).

Com a finalidade de descartar uma possível contaminação das ninhadas com

TMEV, tendo em vista que os sinais de encefalite dos animais infectados com TMEV

são semelhantes aos sintomas dos animais inoculados com os vírus dengue

mutados e neuroadaptados, foi realizada uma reação em cadeia da polimerase

quantitativa em tempo real (qPCR), de acordo com o protocolo de Jin et al. (2007).

Para tanto, 4µg do RNA total extraído de cada cérebro infectado (item 4.2) foi

submetido a uma reação de transcrição reversa (cDNA) utilizando o kit Impron II

Reverse Trasnscriptase (Promega), seguindo recomendações do fabricante,

contendo 20µM do oligonucleotídeo iniciador oligo(dT) e a reação foi incubada a

42ºC por 2 horas. Após o término da reação, as amostras foram diluídas para

concentração final de 2ng/µL com água livre de RNases. O cDNA resultante foi

utilizado na reação de qPCR com 100nM dos oligonucleotídeos iniciadores

específicos (Quadro 3.9) e SYBR Green Master Mix (Applied Biosystems) conforme

recomendação do fabricante. Nesse protocolo foram utilizadas as seguintes

condições de temperatura: 50ºC por 2 min., 95ºC por 10 min., seguidos de 40 ciclos

de 95ºC for 15 seg. e 60ºC por 1 min., em um ABI PRISM 7500 Detection System

(Applied Biosystem). Curvas de dissociação foram utilizadas para verificar a

especificidade do produto e consistiu de uma incubação em que temperatura foi

aumentada de 60ºC a 96ºC numa taxa de aproximadamente 1ºC/40 seg., com leitura

contínua da fluorescência.

3.4.4 Análise da replicação viral dos vírus dengue recombinantes e

controles no sistema nervoso central de camundongos por PCR em tempo real

Para quantificar o RNA viral presente no tecido cerebral de camundongos

infectados com os vírus recombinantes e controles, foi realizada uma reação de

qRT/PCR, de acordo com o protocolo descrito por Poersch et al., (2005).

A qRT/PCR foi realizada no ABI PRISM 7500 Detection System (Applied

Biosystem). O RNA total extraído dos tecidos cerebrais (item 4.2) foi utilizado na

reação contendo a concentração recomendada de MultiScribe Enzyme plus RNase

Inhibitor e TaqMan Universal RT-PCR Master Mix (Applied Biosystems), 400nM dos

oligonucleotídeos específicos para DENV1 e 300nM da sonda específica para

DENV1 (Quadro 3.9). As condições de temperatura foram: 1 ciclo de 48ºC por 30

min. e 1 ciclo de 95ºC por 10 min., seguidos de 40 ciclos de 95ºC por 15 seg. e 60ºC

por 1 min.

Os dados da amplificação do RNA viral por qRT/PCR foram normalizados,

utilizando o gene de expressão constitutiva gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase de

Mus musculus (murGAPDH). Para tanto, o RNA de cada vírus recombinante e

controles foi submetido a uma reação de transcrição reversa (cDNA) conforme

descrito no item 3.4.3. O cDNA resultante foi utilizado na reação de qPCR com

250nM dos oligonucleotídeos iniciadores específicos de murGAPDH e SYBR Green

Master Mix (Applied Biosystems) conforme recomendações do fabricante, e

submetidas às seguintes condições de temperatura: 50ºC por 2 min., 96ºC por 10

min., seguidos de 40 ciclos de 96ºC for 15 seg. e 62ºC por 30 seg. A curva de

dissociação foi utilizada para verificar a especificidade do produto.

3.4.5 Análise do perfil da expressão gênica no sistema nervoso central

de camundongos infectados com vírus recombinantes e controles por PCR em

tempo real

Baseando-se em dados anteriores do grupo (BORDIGNON et al., 2008), que

mostram o perfil da expressão gênica em vias diferencialmente expressas durante a

infecção do SNC de camundongos com cepas neurovirulentas, foram escolhidos 7

genes (Quadro 3.10) para análise por qPCR do perfil da expressão gênica no tecido

cerebral dos camundongos infectados com os vírus recombinantes e controles.

Quadro 3.9 – Oligonucleotídeos iniciadores utilizados para reações de amplificação por qPCR.

Quadro 3.10 – Identificação dos genes e vias escolhidas para o

estudo do perfil da expressão gênica no tecido cerebral de

camundongos infectados com os vírus recombinantes e controles.

Para tanto, 4µg do RNA total extraído de cada cérebro infectado foi submetido

a uma reação de transcrição reversa (cDNA), conforme descrito no item 3.4.3. Após

o término da reação, as amostras foram diluídas para concentração final de 2ng/µL

com água livre de RNases. As amostras foram aliquotadas e armazenadas a –20ºC

até o momento de sua utilização. O cDNA resultante foi utilizado na reação de qPCR

com 250nM dos oligonucleotídeos iniciadores específicos para cada um dos genes-

alvo (Quadro 3.11) e SYBR Green Master Mix (Applied Biosystems) conforme

instruções do fabricante. Nesse protocolo foram utilizadas as seguintes condições de

temperatura: 50ºC por 2 min., 96ºC por 10 min., seguidos de 40 ciclos de 96ºC for 15

seg. e 60ºC por 30 seg. e extensão a 72ºC por 1 min., em um ABI PRISM 7500

Detection System (Applied Biosystem). Curvas de dissociação foram utilizadas para

verificar a especificidade do produto.

O gene GAPDH foi utilizado para normalizar os resultados de cada um dos

genes testados. A normalização foi realizada dividindo o valor obtido por qPCR para

o gene em uma amostra, pelo valor do gene GAPDH da mesma amostra. A

modulação da expressão dos genes nos animais infectados foi definida como: a

razão entre o valor do gene normalizado de uma amostra, dividido pelo valor de

pBACDV1 para o mesmo gene. Desta forma, se obtém o valor da modulação na

expressão de um dado gene por qPCR, para cada mutação em estudo.

3.4.6 Análise histopatológica dos vírus recombinantes e controles

Para avaliar o comprometimento do sistema nervoso central (SNC) durante a

infecção pelos vírus recombinantes, foram analisados cérebros de animais

infectados, pela técnica de histopatologia. Os cérebros dos animais infectados foram

coletados com 10 dpi, quando os animais começaram a apresentar sinais de doença

e envolvimento do SNC, e foram imediatamente fixados por imersão em solução de

10% formalina. O processamento dos materiais e a análise das lâminas foram feitos

em colaboração com a Profa. Dra. Lucia Noronha, do Laboratório de Patologia

Experimental da PUC/PR.

Quadro 3.11 – Oligonucleotídeos iniciadores utilizados nas reações de amplificação

por qPCR para o estudo do perfil da expressão gênica no tecido cerebral de

camundongos infectados com os vírus recombinantes e controles. Fonte:

BORDIGNON, 2008.

Os tecidos cerebrais foram fixados por um período de aproximadamente 48

horas e, em seguida, foram desidratados em banhos sucessivos em álcool 70%,

80%, 90% e dois banhos em álcool 100%, diafanizados em três banhos de xilol e

impregnados por três banhos em parafina líquida a 65ºC, todos por 1 hora,

utilizando-se o equipamento histotécnico marca Leica, modelo TP1020. As amostras

foram então incluídas em parafina utilizando-se o inclusor marca Leica, modelo

EG1160. Os cortes histológicos com cerca de 5 micrômetros foram obtidos

utilizando-se micrótomo marca Leica, modelo RM2145.

Para observação dos danos no tecido cerebral, os cortes histológicos em

parafina foram cuidadosamente estirados em banho-maria a 60ºC, colocados em

lâmina de vidro com albumina, para aderência do corte histológico à lâmina, e

secados em estufa a 60ºC por aproximadamente 1 hora. Posteriormente, as lâminas

contendo os cortes histológicos foram submetidas aos processos de

desparafinização, desidratação e re-hidratação. A desparafinização consistiu de três

banhos sucessivos de 5 min. com xilol aquecido, enquanto a desidratação consistiu

de três banhos sucessivos de 2 min. com álcool etílico absoluto, sendo então os

cortes re-hidratados com água por 10 min. Os tecidos foram corados com

hematoxilina e eosina (coloração básica para núcleo e citoplasma das células),

analisados em microscópio de luz Nikon Eclipse E600 e fotografados utilizando-se o

programa Image-Pro Plus versão 4.5 (MediaCybernetics, Bethesda MD).

Para as análises de imunohistoquímica, as amostras de tecido fixadas foram

incubadas com anticorpo monoclonal, específico para flavivirus (4G2) diluído (1:100

em 1xPBS), incubadas por 30 min. a 37ºC e lavadas 3 vezes por 5 min.

Posteriormente, foram incubadas com anticorpo secundário de cabra anti-

camundongo conjugado com peroxidase em polímero de dextran

(Envision/Peroxidade, DakoCytomation) também por 30 min., a 37ºC. A reação foi

revelada utilizando-se o Liquid DAB (DaKoCytomation), e a recuperação do antígeno

com o ImmunoRetriever Bio SB Kit.

3.5. Novas mutações NS3-480

Para tentar definir a importância da característica do aminoácido no processo

de neurovirulência, foram gerados 10 novos clones substituindo a mutação NS3-480

por novos aminoácidos com diferentes características de carga e índices de

hidrofobicidade (Quadro 3.12).

Quadro 3.12 – Novos aminoácidos selecionados para clonagem na posição NS3-480,

para avaliação da importância da característica do aminoácido no processo de

neurovirulência. Identificado na primeira linha, o aminoácido do vírus parental não

virulento FGA/89, e na segunda, o aminoácido na cepa neurovirulenta FGA/NA-P6.

FONTE: Lehninger Principles of Biochemistry, 4ª edição.

A amplificação das mutações (Quadro 3.12) e a inserção de uma mutação

silenciosa que modifica a sequência de um sítio da enzima de restrição BsaBI foi

realizada por PCR de fusão conforme descrito no item 3.1.1 (Quadro 3.13),

utilizando como molde o genoma viral do clone infeccioso pBACDV1. Todos os

fragmentos foram clonados e amplificados em células de inseto, seguindo a mesma

metodologia empregada para gerar os demais clones descritos neste trabalho.

Quadro 3.13 – Oligonucleotídeos iniciadores utilizados para amplificação dos fragmentos NS3-480.

4. RESULTADOS

4.1 Localização das mutações no genoma viral

A primeira etapa do trabalho foi a identificação e o mapeamento das

mutações no genoma viral potencialmente responsáveis pelo fenótipo de

neurovirulência observado nos animais. As mutações na proteína de Envelope

(E402 e E405) estão localizadas na estrutura predita da haste, na região !-hélice

putativa denominada elemento H1

pred

(item 1.4.2) (ALLISON et al., 1999) (Figura

4.1).

Figura 4.1 – Localização das mutações da proteína de Envelope. A. Representação esquemática

da proteína E inteira, onde o domínio I está indicado em vermelho, o domínio II em amarelo e

domínio III em azul. A região da haste está representada em lilás e a âncora transmembrana em

verde. B. Vista detalhada da sequência de aminoácidos 333 a 495, mostrando as regiões preditas

pred

e H2

pred

da haste, e domínios TM1 e TM2 da âncora transmembrana. As setas vermelhas

indicam a posição das mutações. C. Representação esquemática do monômero da proteína de

Envelope do vírus TBE (Tick-Borne Encephalitis), seguindo o mesmo esquema de cores da figura

(A), adaptado de Allison et al. (1999), não escalonado. Além dos domínios da proteína, haste e

âncora transmembrana, estão também representados, o local de clivagem da tripsina e a posição

do peptídeo de fusão.

As mutações na proteína NS3 estão localizadas no domínio helicase, o qual

compreende os aminoácidos 180 a 619 (Item 1.4.3). A mutação NS3-209 está

localizada no domínio I da helicase, logo após o motivo I, também chamado de

Walker A. Já as mutações NS3-435 e NS3-480 estão localizadas no domínio II, logo

após os motivos V e VI, respectivamente (XU et al., 2005) (Figura 4.2).

Figura 4.2 – Localização das mutações na proteína NS3. A. Representação da proteína NS3

inteira, onde domínio serina protease está indicado em vermelho e o domínio helicase está

em diferentes tons de azul. B. Vista detalhada da sequência dos aminoácidos 167 a 498,

mostrando os domínios conservados na superfamília 2 das helicases, indicados pelas cores

lilás (motivo I ou Walker A), salmão (motivo Ia), verde (motivo II ou Walker B), azul (motivo

III), amarelo (motivo IV), bordô (motivo V) e cinza (motivo VI). As setas vermelhas indicam a

posição das mutações. C. Representação diagramática do domínio helicase da proteína NS3

e localização das mutações, sendo os subdomínios I, II e III representados em rosa, azul e

marrom, respectivamente. As setas pretas indicam a posição das mutações (modificado de

BORDIGNON, J. (2008) e STROTTMANN, D.M. (2008)).

4.2 Construção de clones recombinantes

Uma vez mapeadas as mutações a etapa seguinte foi a construção dos

clones recombinantes. O DNA do clone infeccioso pBACDV1 serviu como molde

para a síntese dos fragmentos contendo as mutações em estudo, pela amplificação

dos genes correspondentes às proteínas de E e NS3. Para tanto, foi realizada uma

PCR de fusão, que consistiu em duas etapas: na primeira reação eram amplificados

dois fragmentos (fragm A e fragm B) para cada mutação, e na segunda etapa era

feita a fusão destes fragmentos (fragm fusão – F) através da complementaridade das

sequências dos oligonucleotídeos iniciadores de polaridade negativa do fragm A e

polaridade positiva do fragm B. A estratégia utilizada para a inserção da mutação

NS3-435 foi a amplificação por PCR de um fragmento único (Tabela 3.1 – item

3.1.1).

A Figura 4.3 mostra o perfil eletroforético dos fragmentos de DNA

amplificados e purificados em kit comercial, referentes a cada estratégia, sendo o

tamanho de cada fragmento correspondente ao esperado (Tabela 3.1 – item 3.1.1).

Os fragmentos de fusão purificados das mutações E402, E405 e NS3-435,

que apresentaram dificuldades na clonagem clássica em pBACDV1, foram

primeiramente clonados diretamente em sistema pGEM-T Easy para posterior

transferência do fragmento para pBACDV1. A clonagem foi realizada seguindo

Figura 4.3 – Eletroforese em gel de agarose 0,8% das amplificações dos fragmentos

mutados. 1Kb+ – marcador de peso molecular 1Kb plus (Invitrogen), A – fragm A, B –

fragm B, e F – fragm de fusão, para cada estratégia de mutação.

protocolo do fabricante, com uma proporção de 1:3 (vetor:inserto) e as reações

foram incubadas a 16°C ou 4°C por um período de 16 horas.

As ligações foram utilizadas para transformar bactérias TOP10F’ cálcio-

competentes. As colônias brancas resultantes foram transferidas para uma nova

placa numerada para identificação dos possíveis clones. Algumas colônias (entre 4 e

6) de cada clone foram inoculadas em 3mL de meio LB líquido. As culturas foram

então sedimentadas por uma breve centrifugação e foram utilizadas para extração

do DNA plasmidial com o kit Wizard Plus SV Miniprep kit, seguindo protocolo do

fabricante. Estes DNAs foram submetidos a sequenciamento nucleotídico para

confirmação de sua sequência, sendo imprescindível a ausência de mutações

aleatórias. A Figura 4.4 mostra o perfil eletroforético das minipreps dos clones

confirmados por sequenciamento, E402pGEM_cl.12, E405pGEM_cl.9 e NS3-

435pGEM_cl.11.

As minipreps dos clones confirmados por sequenciamento E402pGEM_cl12,

E405pGEM_cl.9 e NS3-435pGEM_cl.11 (Figura 4.4), e os fragmentos de PCR

purificados NS3-209 e NS3-480 (Figura 4.3) foram digeridos com as endonucleases

de restrição de acordo com a respectiva estratégia de clonagem, seguindo protocolo

do fabricante.

Os clones E402pGEM_cl12. e E405pGEM_cl.9 foram digeridos com as

endonucleases de restrição NotI e MluI, gerando cinco fragmentos de diferentes

Figura 4.4 – Eletroforese em gel de agarose 0,8% das

minipreparações em pGEM-T Easy dos clones

confirmados por sequenciamento. 1Kb+ – marcador de

peso molecular 1Kb plus (Invitrogen), E402 – miniprep do

clone 12, E405 – miniprep do clone 9, e NS3-435 –

miniprep do clone 11.

tamanhos devido à presença de outros sítios NotI e MluI na sequência do plasmídeo

pGEM-T Easy. O fragmento de interesse de 2.625 pares de base (pb) (Figura 3.4 –

item 3.1.7) foi purificado pela excisão de gel de agarose (Figura 4.5). O clone

pBACDV1 foi digerido com as mesmas enzimas, e o fragmento de 15.245pb foi

igualmente purificado (Figura 4.5).

O fragmento de DNA purificado NS3-209 foi digerido com as endonucleases

de restrição MluI e BsiWI, gerando três fragmentos. O fragmento de interesse de

2.571pb (Figura 3.5 – item 3.1.7) foi purificado pela sua excisão do gel de agarose

(Figura 4.5). O clone pBACDV1 foi digerido com as mesmas enzimas, e o fragmento

de 15.299pb foi igualmente purificado (Figura 4.5).

O clone NS3-435pGEM_cl.11 foi digerido com as endonucleases de restrição

BsiWI e RsrII, gerando dois fragmentos, sendo que o de 683pb (Figura 3.6 – item

3.1.7) foi purificado por excisão de gel de agarose (Figura 4.5). O clone pBACDV1 foi

digerido com as mesmas enzimas, e o fragmento de 17.187pb foi igualmente

purificado (Figura 4.5).

O fragmento de DNA purificado NS3-480 foi digerido com as endonucleases

de restrição BsiWI e NheI, gerando três fragmentos. O fragmento de interesse de

1.604pb (Figura 3.7 – item 3.1.7) foi purificado por excisão de gel de agarose (Figura

4.5). O clone pBACDV1 foi digerido com as mesmas enzimas, e o fragmento de

16.266pb foi igualmente purificado (Figura 4.5).

Figura 4.5 – Eletroforese em gel de agarose 0,8% das digestões dos fragmentos contendo as

mutações para cada estratégia. 1Kb+ – marcador de peso molecular 1Kb plus (Invitrogen). 1 –

pBACDV1 NotI/MluI, 2 – E402pGEM_cl.12 NotI/MluI, 3 – E405pGEM_cl.9 NotI/MluI, 4 – pBACDV1

MluI/BsiWI, 5 – NS3-209 MluI/BsiWI, 6 – pBACDV1 BsiWI/RsrII, 7 – NS3-435pGEM_cl.11

BsiWI/RsrII, 8 – pBACDV1 BsiWI/NheI e 9 – NS3-480 BsiWI/NheI.

Cada amostra de DNA gerada foi utilizada para clonagem no clone pBACDV1

pela substituição da região correspondente, seguindo protocolo da enzima T4 DNA

ligase. As ligações foram utilizadas para transformar bactérias TOP10 cálcio-

competentes. As colônias resultantes foram transferidas para uma nova placa

numerada para identificação dos possíveis clones. Algumas colônias de cada clone

foram submetidas à triagem através da técnica de PCR de colônia e posterior

digestão para confirmação de prováveis clones. Os sítios de restrição utilizados para

confirmação dos clones eram modificados pela inserção de uma mutação silenciosa

no oligonucleotídeo iniciador do PCR de fusão de acordo com cada estratégia

(Tabela 3.3 – item 3.1.9).

A transformação da reação de ligação E402pBAC resultou em apenas 5

colônias, identificadas como col.12.1, col.12.2, col.12.3, col.12.4 e col.12.5. Por ser

um número pequeno, não foi realizada a etapa de PCR de colônia e as colônias

foram diretamente inoculadas em 20mL de meio TB líquido e crescidas a 30ºC por

16 horas. As culturas foram sedimentadas e utilizadas para extração do DNA

plasmidial utilizando kit Wizard Plus SV Miniprep kit e eluídas em 50µL de água

fornecida no kit. Como o sequenciamento de clones em vetor BAC é dificultado pelo

seu baixo rendimento, a região clonada foi amplificada por PCR para posterior

sequenciamento. Foram realizadas 3 amplificações por clone (Tabela 3.4 – item

3.1.10), que foram purificadas por excisão de gel de agarose e submetidas a

sequenciamento (Tabela 3.5 – item 3.1.10). A Figura 4.6A mostra o perfil

eletroforético das minipreparações (minipreps) dos clones E402pBAC e a Figura

4.6B, a amplificação por PCR dos fragmentos enviados para sequenciamento.

As colônias bacterianas transformadas com o clone E405pBAC foram triadas

por PCR de colônia utilizando os oligonucleotídeos iniciadores D1DomB+ e NarXho-,

resultando em fragmentos de 589pb (tabela 3.3 – item 3.1.9). Estes fragmentos

foram submetidos à digestão pela endonuclease de restrição BstBI para

confirmação. Os clones negativos, que não possuem a mutação de interesse nem a

mutação silenciosa no sítio BstBI, apresentam um perfil de digestão com duas

bandas, de 307pb e 282pb. Já os clones positivos, que possuem as mutações, não

são digeridos, resultando no fragmento de 589pb intacto (Figura 4.7). A Figura 4.8

mostra o perfil eletroforético dos fragmentos de DNA gerados por PCRs de colônia

do clone E405pBAC e suas respectivas digestões confirmatórias.

Figura 4.6 – Eletroforese em gel de agarose 0,8% das minipreps e

PCRs das minipreps dos clones E402pBAC. 1Kb+ – marcador de

peso molecular 1Kb plus (Invitrogen). A – minipreps, onde 12.1 a 12.5

é a identificação da miniprep de cada colônia testada. B – fragmentos

amplificados por PCR, não purificados, das minipreps E402pBAC,

para sequenciamento.

Todas as colônias bacterianas do clone E405pBAC foram positivas para

presença da mutação de interesse E405. Por ser imprescindível a ausência de

mutações aleatórias, os clones E405pBAC cl.9.5, cl.9.7, cl.9.13 e cl.9.17 foram

escolhidos para confirmação de sua sequência nucleotídica por sequenciamento.

Estes clones foram inoculados em meio líquido e a extração do DNA plasmidial foi

realizada como descrito anteriormente para os clones E402. O DNA das reações de

minipreps foram amplificadas por PCR com os oligonucleotídeos D1+ e D18- (Tabela

3.4 – item 3.1.10), resultando em fragmentos de DNA de 2.720pb, que foram

purificadas por excisão de gel de agarose e submetidas a sequenciamento (Tabela

Figura 4.8 – Eletroforese em gel de agarose 0,8% da digestão confirmatória dos PCRs de

colônia dos clones E405pBAC. 1Kb+ – marcador de peso molecular 1Kb plus (Invitrogen).

A – PCRs de colônia, onde 1 a 20 é a identificação de cada colônia testada e CN é o

controle negativo (PCR do clone pBACDV1). B – digestão dos PCRs de colônia com

enzima BstBI, onde 1 a 20 é a identificação de cada colônia testada e CN é o controle

negativo.

Figura 4.7 – Representação esquemática do perfil da digestão BstBI confirmatória dos PCRs de

colônia dos clones E405pBAC. A – representação do clone negativo. B – representação do

clone positivo.

3.5 – item 3.1.10). A Figura 4.9A mostra o perfil eletroforético do DNA obtido por

minipreps dos clones E405pBAC e a Figura 4.9B, a amplificação dos fragmentos de

DNA respectivos.

Todas as 13 colônias bacterianas obtidas do processo de clonagem da NS3-

209pBAC foram amplificadas com os oligonucleotídeos iniciadores CN10+ e CN20-,

resultando em fragmentos de 831pb. Estes fragmentos foram submetidos à digestão

pela endonuclease de restrição EcoRV para confirmação. Como o fragmento

amplificado possui um sítio EcoRV a mais, fora da região da mutação, os clones

negativos apresentam um perfil de digestão com três bandas, com os tamanhos de

499, 215 e 117pb. Já os clones positivos, apresentam um perfil de dois fragmentos,

de 499 e 332pb (Figura 4.10). A Figura 4.11 mostra o perfil eletroforético das

amostras de DNA obtidas por PCRs de colônia de NS3-209pBAC e suas respectivas

digestões confirmatórias.

Figura 4.9 – Eletroforese em gel de agarose 0,8% das minipreps e PCRs das minipreps

dos clones E405pBAC. 1Kb+ – marcador de peso molecular 1Kb plus (Invitrogen). A –

minipreps, onde 9.5 a 9.17 é a identificação da miniprep de cada colônia testada. B –

PCRs não purificadas das minipreps E405pBAC, para sequenciamento, onde BR é o

controle negativo (água).

100

Das 13 colônias geradas no processo de clonagem de NS3-209pBAC

testadas pela técnica de PCR colônia e digestão, 7 foram positivas para presença da

mutação de interesse NS3-209. Por ser imprescindível a ausência de mutações

aleatórias, todos clones NS3-209pBAC positivos, denominados cl.83, cl.85, cl.86,

cl.87, cl.92, cl.93 e cl.94, foram escolhidos para confirmação de sua sequência

Figura 4.10 – Representação esquemática do perfil da digestão EcoRV confirmatória dos PCRs

de colônia dos clones NS3-209pBAC. A – representação do clone negativo. B – representação do

clone positivo.

Figura 4.11 – Eletroforese em gel de agarose 0,8% da digestão confirmatória

dos PCRs de colônia dos clones NS3-209pBAC. 1Kb+ – marcador de peso

molecular 1Kb plus (Invitrogen). A – PCRs de colônia, onde 82 a 94 é a

identificação de cada colônia testada e CN é o controle negativo (PCR do clone

pBACDV1). B – digestão dos PCRs de colônia com enzima EcoRVI, onde 82 a

94 é a identificação de cada colônia testada e CN é o controle negativo.

101

nucleotídica. Estes clones foram inoculados em meio líquido e a extração do DNA

plasmidial foi realizada como descrito anteriormente para os clones E402. O DNA

das minipreps foram amplificadas com os oligonucleotídeos PhD20+ e CN20-

(Tabela 3.4 – item 3.1.10), resultando em fragmentos de peso molecular de 3.550pb,

que foram purificadas por excisão de gel de agarose e submetidas ao

sequenciamento (Tabela 3.5 – item 3.1.10). A Figura 4.12 mostra o perfil

eletroforético do DNA referente aos clones NS3-209pBAC e a amplificação dos

mesmos por PCR.

Quatro colônias bacterianas obtidas após a transformação da ligação NS3-

435pBAC foram escolhidas e identificadas como col.11.1, col.11.2, col.11.3 e

col.11.4. Para se verificar a inserção desta mutação no clone, as colônias foram

diretamente inoculadas em meio liquido para a miniprep de DNA do clone (Figura

4.13 A). Após a obtenção do DNA plasmidial, a região clonada foi amplificada por

PCR com os oligonucleotídeos D23+ e Hel3’ (Quadro 3.4 – item 3.1.10), resultando

em fragmentos de 1.500pb, que foram utilizados para o seqüenciamento nucleotidico

(Figura 4.13B) (Quadro 3.5 – item 3.1.10).

Figura 4.12 – Eletroforese em gel de agarose 0,8% das minipreps e PCRs a partir das

minipreps dos clones NS3-209pBAC. 1Kb+ – marcador de peso molecular 1Kb plus

(Invitrogen). A – minipreps, onde 83 a 94 é a identificação de cada colônia testada. B –

fragmentos de DNA das amplificações por PCR não purificados das minipreps do clone NS3-

209pBAC, para sequenciamento.

102

As colônias bacterianas obtidas no processo de clonagem da amostra NS3-

480pBAC foram amplificadas com os oligonucleotídeos iniciadores CN14+ e Hel3’,

resultando em fragmentos de 753pb (Quadro 3.3 – item 3.1.9). Estes fragmentos

foram submetidos à digestão pela endonuclease de restrição BsaBI para

confirmação. Os clones negativos apresentam um perfil de digestão com duas

bandas, de 411 e 342pb. Já os clones positivos, não são digeridos, resultando no

fragmento de 753pb intacto (Figura 4.14). A Figura 4.15 mostra o perfil eletroforético

dos PCRs de colônia NS3-480pBAC e suas respectivas digestões confirmatórias.

Figura 4.14 – Representação esquemática do perfil da digestão BsaBI confirmatória dos PCRs de

colônia dos clones NS3-480pBAC. A – representação do clone negativo. B – representação do

clone positivo.

Figura 4.13 – Eletroforese em gel de agarose 0,8% das minipreps e PCRs das minipreps

dos clones NS3-435pBAC. 1Kb+ – marcador de peso molecular 1Kb plus (Invitrogen). A –

minipreps, onde 11.1 a 11.4 é a identificação da miniprep de cada colônia testada. B –

PCRs purificadas das minipreps NS3-435pBAC, para sequenciamento, onde BR é o

controle negativo (água).

103

Das 11 colônias bacterianas obtidas da clonagem da amostra NS3-480pBAC

que foram testadas pela técnica de PCR colônia e digestão, 6 foram positivas para

presença da mutação de interesse NS3-480. Por ser imprescindível a ausência de

mutações aleatórias, todos os clones NS3-480pBAC positivos, denominados cl.2,

cl.3, cl.4, cl.5, cl.8 e cl.9, foram escolhidos para confirmação de sua sequência

nucleotídica. Estes clones foram inoculados em meio líquido e a extração do DNA

plasmidial foi realizada como descrito anteriormente para os clones E402. As

minipreps referentes a esses clones foram amplificadas por PCR com os

oligonucleotídeos CN10+ e D6-, resultando em fragmentos de 2.083pb (Quadro 3.4

– item 3.1.10), que foram purificados e seqüenciados (Quadro 3.5 – item 3.1.10). A

Figura 4.16 mostra o perfil eletroforético das minipreps dos clones NS3-480pBAC e a

amplificação dos respectivos PCRs.

Figura 4.15 – Eletroforese em gel de agarose 0,8% da digestão confirmatória

dos PCRs de colônia dos clones NS3-480pBAC. 1Kb+ – marcador de peso

molecular 1Kb plus (Invitrogen). A – PCRs de colônia, onde 1 a 11 é a

identificação de cada colônia testada. B – digestão dos PCRs de colônia com

enzima BsaBI, onde 1 a 11 é a identificação de cada colônia testada.

104

Os clones em que cada uma das mutações de interesse foi inserida foram

identificados como: E402pBAC_cl.12.2, E405pBAC_cl.9.13, NS3-209pBAC_cl.85,

NS3-435pBAC_cl.11.4 e NS3-480pBAC_cl.9 (Quadro 4.1). Estes clones foram

utilizados para a inserção de outras mutações para a obtenção dos clones duplos e

triplo mutantes (Item 3.1.11), referentes à combinação das mutações localizadas nas

proteínas E e NS3, de cada um dos vírus neuroadaptados (FGA/NA-d1d e FGA/NA-

P6 – Quadro 1.1, item 1.5).

O clone duplo mutante E405/NS3-435 foi construído pela inserção da

mutação NS3-435, do clone NS3-435pGEM_cl.11, no clone E405pBAC_cl.9.13,

através da substituição do fragmento BsiWI/RsrII. Para o clone E402/NS3-209, a

construção foi feita pela inserção da mutação NS3-209 do clone NS3-

209pBAC_cl.85, na construção E402pBAC_cl.12.2, com a substituição do fragmento

MluI/BsiWI. O duplo mutante E402/NS3-480 foi gerado pela inserção da mutação

NS3-480 do clone NS3-480pBAC_cl.9, no clone E402pBAC_cl.12.2, pela

substituição do fragmento BsiWI/NheI, e o clone triplo mutante E402/NS3-209/NS3-

480 foi construído pela inserção da mutação NS3-480 do PCR de fusão purificado,

no clone duplo mutante E402/NS3-209_cl.85 pela substituição do fragmento

BsiWI/NheI (Figura 4.17).

Figura 4.16 – Eletroforese em gel de agarose 0,8% das minipreps e PCRs das

minipreps dos clones NS3-480pBAC. 1Kb+ – marcador de peso molecular 1Kb plus

(Invitrogen). A – minipreps, onde 2 a 9 é a identificação da miniprep de cada colônia

testada. B – fragmentos da amplificação dos PCR não purificados das minipreps NS3-

480pBAC, para sequenciamento.

105

A Figura 4.18 mostra o perfil eletroforético das digestões purificadas para

construção dos clones duplos e triplo mutantes.

Figura 4.18 – Eletroforese em gel de agarose 0,8% das digestões dos fragmentos

contendo as mutações para estratégias dos duplos mutantes. 1Kb+ – marcador de peso

molecular 1Kb plus (Invitrogen). 1 – E405pBAC_cl.9.13 BsiWI/RsrII, 2 – NS3-

435pGEM_cl.11 BsiWI/RsrII, 3 – E402pBAC_cl.12.2 MluI/BsiWI, 4 – NS3-209pBAC_cl.85

MluI/BsiWI, 5 – E402pBAC_cl.12.2 BsiWI/NheI, 6 – NS3-480pBAC_cl.9 BsiWI/NheI, 7 –

E402/NS3-209_cl.85 BsiWI/NheI e 8 – NS3-480 BsiWI/NheI.

Figura 4.17 – Esquema das estratégias dos clones duplo e triplo mutantes pela substituição de

fragmentos. Nos clones E405/NS3-435, E402/NS3-209 e E402/NS480, as cores representam o

backbone e os fragmentos utilizados para a clonagem da segunda mutação. As estrelas pretas

indicam a localização de cada mutação.

106

A Figura 4.19 mostra o perfil eletroforético da triagem das colônias

bacterianas obtidas na construção E405/NS3-435, pela técnica de PCR de colônia.

Estes fragmentos foram amplificados com os oligonucleotídeos iniciadores D23+ e

Hel3’ (1.500pb) (Quadro 3.4 – item 3.1.10), com enzima de alta fidelidade, e

seqüenciados (Quadro 3.5 – item 3.1.10).

Após a determinação da seqüência nucleotidica o clone 3, identificado como

E405/NS3-435_cl.3, foi selecionado para prosseguir com as costruções. (Figura

4.21).

Todas as colônias bacterianas crescidas, para a obtenção do clone

E402/NS3-209, foram amplificadas com os oligonucleotídeos iniciadores CN10+ e

CN20-, gerando fragmentos de 831pb, que foram submetidos à digestão pela

endonuclease de restrição EcoRV para confirmação. A Figura 4.20 mostra o perfil

eletroforético da triagem destas colônias, pela técnica de PCR de colônia, e suas

respectivas digestões confirmatórias.

A Figura 4.21 mostra o perfil eletroforético da triagem das únicas 6 colônias

bacterianas resultantes do processo para obtenção do clone E402/NS3-480. Os

oligonucleotídeos iniciadores CN14+ e Hel3’, foram usados para amplificar

fragmentos de 753pb, que foram submetidos à digestão pela endonuclease de

restrição BsaBI para confirmação.

Figura 4.19 – Eletroforese em gel de agarose 0,8% da amplificação dos PCRs de colônia

dos clones E405/NS3-435, onde 1Kb+ é o marcador de peso molecular 1Kb plus

(Invitrogen) e 1 a 11 é a identificação de cada colônia testada, CO é o controle positivo da

amplificação (PCR do clone E405pBAC_cl.9.13) e BR é o branco (água).

107

Figura 4.20 – Eletroforese em gel de agarose 0,8% da amplificação e digestão confirmatória dos

PCRs de colônia dos clones E402/NS3-209. 1Kb+ – marcador de peso molecular 1Kb plus

(Invitrogen). A – PCRs de colônia, onde 1 a 29 é a identificação de cada colônia testada, CN é o

controle negativo (PCR do clone pBACDV1) e CP é o controle positivo (PCR do clone NS3-

209pBAC_cl.85). B – digestão dos PCRs de colônia com enzima EcoRV, onde 1 a 29 é a

identificação de cada colônia testada, CN é o controle negativo (PCR do clone pBACDV1) e CP é

o controle positivo (PCR do clone NS3-209pBAC_cl.85).

108

Três colônias bacterianas positivas de cada clonagem, E402/NS3-209

colônias 10, 13 e 17, e E402/NS3-480 colônias 89, 91 e 94 foram selecionadas e o

DNA plasmidial purificado e caracterizadas. (Figura 4.22).

Figura 4.21 – Eletroforese em gel de agarose 0,8% da amplificação e digestão confirmatória dos

PCRs de colônia dos clones E402/NS3-480. 1Kb+ – marcador de peso molecular 1Kb plus

(Invitrogen). A – PCRs de colônia, onde 89 a 94 é a identificação de cada colônia testada, CN é o

controle negativo (PCR do clone pBACDV1), CP é o controle positivo (PCR do clone NS3-

480pBAC_cl.9) e BR é o branco (água). B – digestão dos PCRs de colônia com enzima BsaBI,

onde 89 a 94 é a identificação de cada colônia testada, CN é o controle negativo (PCR do clone

pBACDV1), CP é o controle positivo (PCR do clone NS3-480pBAC_cl.9).

Figura 4.22 – Eletroforese em gel de agarose 0,8% das minipreps dos

clones duplo mutantes. 1Kb+ – marcador de peso molecular 1Kb plus

(Invitrogen). A – Minipreps dos clones E402/NS3-209 e E402/NS3-480

enviados para sequenciamento, onde 10, 13, 17, 89, 91 e 94 é a

identificação dos possíveis clones. B – Mniprep do clone E405/NS3-435

cl.3 confirmado por sequenciamento.

109

O DNA das minipreps correspondente aos clones E402/NS3-209 e E402/NS3-

480 foi amplificado com diferentes pares de oligonucleotídeos (Quadro 3.6 – item

3.1.11) e posteriormente purificado (Figura 4.23).

A Figura 4.24 mostra o perfil eletroforético das amostras de DNA plasmidial

provenientes das colônias bacterianas obtidas na construção E402/NS3-209/NS3-

480, pela técnica de PCR de colônia. Estes fragmentos foram amplificados com os

oligonucleotídeos iniciadores iniciadores CN14+ e Hel3’, gerando fragmentos de

753pb, que foram submetidos à digestão pela endonuclease de restrição BsaBI para

confirmação (Quadro 3.3 – item 3.1.9).

Figura 4.23 – Eletroforese em gel de agarose 0,8% da amplificação dos PCRs das

minipreps E402/NS3-209 (10, 13 e 17) e E402/NS3-480 (89, 90 e 91), onde 1Kb+ –

marcador de peso molecular 1Kb plus (Invitrogen), 1 a 3 é a identificação do

fragmento amplificado e BR é o branco (água).

110

As colônias bacterianas, identificadas como 10, 15 19, 23, 27 e 30, foram

amplificadas pela técnica de PCR de colônia com os oligonucleotídeos D23+ e D6-,

gerando fragmentos de 2.118pb que foram seqüenciados (Quadro 3.6 – item 3.1.11)

(Figura 4.25A).

Após a caracterização genética, o clone 27 foi selecionado e purificado para

prosseguir nas construções, sendo identificado como E402/NS3-209/NS3-480_cl.27.

(Figura 4.25B).

Figura 4.24 – Eletroforese em gel de agarose 0,8% da amplificação e digestão confirmatória dos PCRs

de colônia dos clones E402/NS3-209/NS3-480. 1Kb+ – marcador de peso molecular 1Kb plus

(Invitrogen). A – PCRs de colônia, onde 1 a 31 é a identificação de cada colônia testada, CN é o controle

negativo (PCR do clone pBACDV1), CP é o controle positivo (PCR do clone NS3-480pBAC_cl.9 e BR é o

branco). B – digestão dos PCRs de colônia com enzima BsaBI, onde 1 a 30 é a identificação de cada

colônia testada, CN é o controle negativo (PCR do clone pBACDV1) e CP é o controle positivo (PCR do

clone NS3-480pBAC_cl.9).

111

Os novos clones que continham a sequência correta foram identificados da

seguinte maneira: E405/NS3-435_cl.3, E402/NS3-209_cl.17, E402/NS3-480_cl.89 e

E402/NS3-209/NS3-480_cl.27 (Quadro 4.1), completando as construções de forma a

obter todas as combinações das mutações localizadas nas proteínas E e NS3,

referente a cada um dos vírus neuroadaptados (FGA/NA-d1d e FGA/NA-P6 –

Quadro 1.1, item 1.5).

Quadro 4.1 – Resumo da identificação dos clones gerados.

Figura 4.25 - Eletroforese em gel de agarose 0,8% dos clones triplo mutantes.

1Kb+ – marcador de peso molecular 1Kb plus (Invitrogen). A – Amplificações por

PCRs dos clones triplo mutante E402/NS3-209/NS3-480 enviados para

sequenciamento, onde 10, 15, 19, 23, 27 e 30 é a identificação dos possíveis clones.

B – Miniprep do clone E402/NS3-209/NS3-480 cl.27 confirmado por sequenciamento.

112

4.3 Geração de vírus recombinantes

4.3.1 Preparação do DNA dos clones e transcrição in vitro

A etapa subseqüente da geração de todos os clones contendo as mutações

de interesse isoladamente ou em conjunto foi a geração dos vírus recombinantes.

Para tal, após a construção e confirmação da correta sequência dos fragmentos

clonados, as minipreps de DNA de cada clone (Figura 4.26) foram linearizadas pela

digestão com a enzima de restrição SwaI, de acordo com os tampões e condições

descritas pelo fabricante. Em seguida, as reações eram purificadas pela extração

com fenol e precipitação com etanol (Figura 4.27).

Figura 4.26 – Eletroforese em gel de agarose 0,8% das minipreps de cada clone

confirmado por sequenciamento. 1Kb+ – marcador de peso molecular 1Kb plus

(Invitrogen). 1 – E402pBAC_cl.12.2, 2 – E405pBAC_cl.9.13, 3 – NS3-209pBAC_cl.85, 4 –

NS3-435pBAC_cl.11.4, 5 – NS3-480pBAC_cl.9, 6 – E405/NS3-435_cl.3, 7 – E402/NS3-

209_cl.17, 8 – E402/NS3-480_cl.89, 9 – E402/NS3-209/NS3-480_cl.27, 10 – pBACDV1.

113

O sítio de reconhecimento da endonuclease de restrição SwaI está

localizado logo após a sequência da ribozima do vírus da hepatite delta (HDV-RZ) e

do sitio de terminação da T7 RNA polimerase (T7 term). As amostras de DNA

clivadas foram utilizadas como molde para reações de síntese de RNA, utilizando o

kit de transcrição in vitro T7 MEGAscript (Ambion) com adição de cap. A transcrição

é iniciada no sitio do promotor da T7 RNA polimerase localizado imediatamente

antes do início do genoma viral e é finalizada no sitio T7 term, transcrevendo

inclusive a sequência HDV-RZ. A ribozima, por ser um RNA com atividade catalítica,

é autoclivada, liberando o RNA exatamente no último nucleotídeo do genoma viral, o

que é de extrema importância para a viabilidade/estabilidade do RNA para o

processo de replicação viral.

Após a reação, as amostras de RNA transcritas foram observadas em gel de

agarose 0,8% livre de RNAses para análise de sua integridade e concentração

(Figura 4.28).

Figura 4.27 – Eletroforese em gel de agarose 0,8% das digestões SwaI das minipreps de

cada clone confirmado por sequenciamento. 1Kb+ – marcador de peso molecular 1Kb plus

(Invitrogen). 1 – E402pBAC_cl.12.2, 2 – E405pBAC_cl.9.13, 3 – NS3-209pBAC_cl.85, 4 –

NS3-435pBAC_cl.11.4, 5 – NS3-480pBAC_cl.9, 6 – E405/NS3-435_cl.3, 7 – E402/NS3-

209_cl.17, 8 – E402/NS3-480_cl.89, 9 – E402/NS3-209/NS3-480_cl.27, 10 – pBACDV1, 11

– controle negativo (pBACDV1 não digerido).

114

4.3.2 Determinação da linhagem celular e método de transfecção

Para determinar a linhagem celular mais adequada e o melhor método de

transfecção dos RNAs, foi realizada uma etapa de padronização, na qual o RNA do

clone pBACDV1 foi utilizado. Foram avaliados protocolos de transfecção por

lipossomo, utilizando lipofectina, e eletroporação em culturas de células de inseto

(C6/36) e mamífero (BHK). A seleção das metodologias e linhagens celulares para

teste foi baseada em experiências anteriores.

As células foram transfectadas com os dois métodos e os sobrenadantes das

culturas foram recolhidos nos tempos de 48, 72, 96 e 120 horas pós-transfecção

para avaliação da eficácia do método através da produção de progênie viral pela

técnica de titulação viral por imunodetecção de foco. Os títulos virais de cada ponto

foram utilizados para gerar gráficos para melhor visualização (Figura 4.29).

Figura 4.28 – Eletroforese em gel de agarose 0,8% dos RNAs resultantes das

transcrições in vitro de cada clone. RL – marcador de peso molecular 0.5-10Kb

RNA (Invitrogen). 1 – E402pBAC_cl.12.2, 2 – E405pBAC_cl.9.13, 3 – NS3-

209pBAC_cl.85, 4 – NS3-435pBAC_cl.11.4, 5 – NS3-480pBAC_cl.9, 6 –

E405/NS3-435_cl.3, 7 – E402/NS3-209_cl.17, 8 – E402/NS3-480_cl.89, 9 –

E402/NS3-209/NS3-480_cl.27, 10 – pBACDV1.

115

Foi possível observar que as culturas células de inseto C6/36 apresentaram

um padrão crescente de titulo viral dentro do intervalo de tempo analisado, enquanto

as culturas de células de mamífero BHK apresentaram um padrão decrescente ao

longo do tempo. A técnica de transfecção por lisossomo resultou em um maior título

viral em 120h pós-transfecção quando comparada com a técnica de eletroporação.

Baseado nestas análises foi escolhida a metodologia de transfecção com lipofectina

em culturas de células de inseto C6/36 para a continuidade do trabalho.

Figura 4.29 – Representação gráfica dos títulos virais obtidos nas

diferentes metodologias de transfecção em células de inseto (em azul)

e mamífero (em vermelho). A – Títulos resultantes do protocolo de

eletroporação. B – Títulos resultantes do protocolo de transfecção por

lipossomo.

116

4.3.3 Transfecção de RNA recombinante em células de inseto C6/36

Os RNAs recombinantes transcritos (Figura 4.27) foram utilizados para

transfecção em células de inseto C6/36 utilizando protocolo com lipofectina. Os

RNAs eram misturados com o lipossomo e a mistura era incubada com a cultura por

um período de 3 horas para sua adsorção. Após este período, o inóculo era

substituído por meio de cultura completo, e a cultura mantida a temperatura

adequada. Os sobrenadantes foram recolhidos nos tempos de 48, 72, 96 e 120

horas pós transfecção, aliquotados e armazenados a –70°C para sua posterior

titulação.

Para avaliar e quantificar a produção de progênie viral, os sobrenadantes

recolhidos foram titulados pela técnica de titulação viral por imunodetecção de foco.

Os títulos virais de cada ponto foram utilizados para gerar um gráfico para melhor

visualização. A Figura 4.30 mostra o gráfico com o crescimento gradual dos títulos

virais dos vírus recombinantes ao longo das horas pós transfecção.

Figura 4.30 – Representação gráfica dos títulos virais obtidos na transfecção dos clones

recombinantes em cultura de células de inseto.

117

4.3.4 Amplificação de estoques virais em cultura de células de inseto e

purificação viral em gradiente de sacarose

Os vírus recombinantes foram amplificados em células de inseto, a fim de

gerar estoques virais de trabalho das amostras transfectadas, produzindo

quantidades suficientes de vírus de mesmo lote para utilização nos experimentos

subsequentes. Para tanto, foram feitas duas passagens em células C6/36, infecções

com MOI de 0.01, a partir do sobrenadante recolhido na transfecção. Os

sobrenadantes da primeira passagem foram recuperados e utilizados tanto para

determinação de seu título, quanto para a infecção subsequente (segunda

passagem). As infecções foram acompanhadas de 5 a 7 dias e foram avaliadas

quanto ao aparecimento de efeito citopático (CPE) quando comparadas com o

controle negativo, mock. Os sobrenadantes da segunda passagem foram

recuperados e precipitados com PEG e NaCl para sua purificação por gradientes de

sacarose, a fim de se obter estoques virais purificados e concentrados. Os estoques

virais foram aliquotados e seus títulos determinados. Os títulos virais das duas

passagens foram utilizados para obter um gráfico para melhor visualização (Figura

4.31).

Figura 4.31 – Representação gráfica dos títulos virais obtidos nas passagens 1 e

2 (pós-gradiente) dos vírus gerados a partir dos clones recombinantes, em cultura

de células de inseto.

118

4.4 Caracterização genética completa dos vírus recombinantes

Após a produção de estoques virais purificados em gradiente de sacarose a

partir dos clones recombinantes, foi realizada a extração de RNA para amplificação e

confirmação da sequência nucleotídica completa do genoma dos vírus.

Para tanto, uma alíquota de 100!L proveniente dos vírus purificados em

gradientes de sacarose foi utilizada para extração de RNA. Os RNAs foram

convertidos em cDNA na presença de Random Primer (100pmol/µL – Invitrogen),

que foram utilizados como molde para amplificação por PCR de fragmentos que

compreendiam o genoma completo dos vírus (Figura 4.32).

Devido à presença de estruturas secundárias, muitas vezes a amplificação da

região 3’UTR não é eficiente, assim sendo, não foi possível realizar a amplificação

do fragmento 6a (Quadro 3.6 – item 3.2.8) na primeira tentativa para alguns clones

(E402pBAC_cl.12.2, E405pBAC_cl.9.13 e NS3-435pBAC_cl.11.4). No entanto, esta

região foi amplificada com as estratégias de amplificação dos fragmentos 6b e 7

(Quadro 3.6 – item 3.2.8) (resultado não mostrado).

Todos os fragmentos foram purificados com kit comercial, por extração de gel

de agarose e foram enviados para sequenciamento na Macrogen (Seoul, Coréia do

Sul) (Quadro 3.7 – item 3.2.8). As sequências nucleotídicas resultantes foram

analisadas e organizadas em uma sequência consenso (contig) utilizando os

programas Phred/Phrap/Consed. As sequências consenso de cada clone foram

alinhadas utilizando o software CLUSTALx e o alinhamento foi analisado e editado

pelo software GENEDOC para melhor visualização das diferenças de nucleotídeos e

aminoácidos entre os vírus mutados.

As Figuras 4.33A e 4.33B mostram o alinhamento das sequências de

aminoácidos dos 10 vírus recombinantes gerados neste trabalho na seguinte ordem:

pBACDV1, E402pBAC_cl.12.2, E405pBAC_cl.9.13, NS3-209pBAC_cl.85, NS3-

435pBAC_cl.11.4, NS3-480pBAC_cl.9, E402/NS3-209_cl.17, E402/NS3-480_cl.89,

E405/NS3-435_cl.3 e E402/NS3-209/NS3-480_cl.27. É possível observar, em preto,

as regiões conservadas entre as sequências. As diferenças de aminoácidos

aparecem em branco e foram destacadas em quadros vermelhos com sua

respectiva identificação. Todas as amostra possuíam apenas a mutação em estudo,

não apresentando outras mutações aleatórias, com exceção da amostra E402/NS3-

119

209/NS3-480_cl.27 que possui uma mutação na posição do nucleotídeo 4.257,

localizado na proteína NS2b, a qual modifica o aminoácido Valina para Alanina,

destacado em azul. Esta mutação extra inviabilizou a utilização do clone, pois pode

mascarar ou modificar os resultados, uma vez que a finalidade do estudo é inferir o

potencial papel de cada mutação individual ou em conjunto dentro do contexto do

fenótipo da neurovirulência. Portanto, este clone foi descartado e a sua clonagem foi

reiniciada pela substituição do fragmento MluI/BsiWI contendo a mutação NS3-209

dentro do clone E402/NS3-480_cl.89.

120

Figura 4.32 – Eletroforeses em gel de agarose 0,8% das amplificações por PCR dos genomas

completos dos vírus recombinantes. A numeração dos fragmentos segue a mesma da Quadro 3.6 –

item 3.2.8. 1Kb+ – marcador de peso molecular 1Kb plus (Invitrogen). A – pBACDV1, B –

E402pBAC_cl.12.2, C – E405pBAC_cl.9.13, D – NS3-209pBAC_cl.85, E – NS3-435pBAC_cl.11.4, F –

NS3-480pBAC_cl.9, G – E405/NS3-435_cl.3, H – E402/NS3-209_cl.17, I – E402/NS3-480_cl.89, J –

E402/NS3-209/NS3-480_cl.27.

121

Figura 4.33A – Alinhamento de aminoácidos das amostras pBACDV1, E402pBAC_cl.12.2,

E405pBAC_cl.9.13, NS3-209pBAC_cl.85, NS3-435pBAC_cl.11.4, NS3-480pBAC_cl.9,

E402/NS3-209_cl.17, E402/NS3-480_cl.89, E405/NS3-435_cl.3 e E402/NS3-209/NS3-

480_cl.27.

122

Figura 4.33B – Ampliação do alinhamento de aminoácidos das amostras pBACDV1,

E402pBAC_cl.12.2, E405pBAC_cl.9.13, NS3-209pBAC_cl.85, NS3-435pBAC_cl.11.4, NS3-

480pBAC_cl.9, E402/NS3-209_cl.17, E402/NS3-480_cl.89, E405/NS3-435_cl.3 e E402/NS3-

209/NS3-480_cl.27, destacando as regiões de localização das mutações estudadas.

123

4.5 Análise comparativa do efeito citopático produzido pelos vírus

recombinantes em culturas de células de inseto C6/36

As cepas virais pBACDV1 (cepa BR/90), FGA/NA-d1d e FGA/NA-P6

utilizadas neste trabalho diferem quanto a produção de efeito citopático (CPE) em

células de inseto. Visando analisar a influência das mutações na possível alteração

do fenótipo em culturas de células de inseto, infecções com todos os vírus em

paralelo foram acompanhadas por 5 a 7 dias e fotografadas.

Na Figura 4.34 é possível observar que as culturas infectadas com as cepas

FGA/NA-d1d e FGA/NA-P6 permanecem sem CPE, não apresentando diferenças

visuais quando comparadas com as culturas infectadas com mock. Entretanto, as

infecções com o vírus pBACDV1 começam a apresentar alguns pontos de fusão

celular já com 4 dias pós infecção, tomando grandes proporções ao longo do tempo

(5 a 7 dias).

Quando as infecções com os vírus mutados foram analisadas, foi possível

observar fusão celular em quase todas as amostras, semelhante ao pBACDV1.

Porém, interessantemente, os vírus E405 e E405/NS3-435 apresentam uma

alteração no fenótipo de fusão, não apresentando CPE, semelhante ao vírus

FGA/NA-d1d, de onde as mutações foram identificadas. É importante ressaltar, que

o vírus contendo apenas a mutação NS3-435 apresenta fusão celular, mas quando

combinado com a mutação E405, deixa de apresentar este efeito na cultura celular.

124

continua na próxima página…

125

Figura 4.34 – Efeito citopático produzido pelos vírus recombinantes em cultura de células de

inseto C6/36 nos tempos de 5, 6 e 7 dias pós-infecção. Aumento de 200x e barra equivalente a

120!m.

126

4.6 Análise comparativa do padrão de infecção dos vírus recombinantes

por imunofluorescência indireta em cultura de células de inseto C6/36

Os vírus recombinantes foram utilizados para infectar células de inseto e

avaliar a sua habilidade de infecção. A Figura 4.35 mostra o padrão de infecção

destes vírus, mostrando que todos os vírus recombinantes infectam eficientemente

células de inseto da linhagem C6/36, sendo capaz de sintetizar proteínas virais,

evidenciado pelo padrão de infecção nas culturas com 5 dpi.

continua na próxima página…

127

Figura 4.35 Análise comparativa da reação de imunofluorescência dos vírus recombinantes em

cultura de células de inseto C6/36 com 5 dias pós-infecção. Culturas celulares marcadas com

anticorpo 4G2, seguido de anti-camundongo conjugado com FITC. Aumento de 400x e barra

equivalente a 70!m.

128

4.7 Ensaio de DL

para inoculação do genoma infeccioso pBACDV1,

vírus recombinantes e controles, em camundongos neonatos

Para dar início à inoculação dos camundongos com os vírus recombinantes

purificados, foi necessário estabelecer a dose ideal do inóculo para o genoma

infeccioso pBACDV1, uma vez que é uma cepa diferente dos demais vírus já

estudados em modelo murino em nosso laboratório. Para tanto, foi realizado um

ensaio de DL

para determinação da dose letal desta cepa.

No grupo inoculado com a maior dose (1.0x10

ffu), a taxa de mortalidade dos

animais atingiu 69.2%, enquanto no grupo dos animais inoculados com a dose

1.0x10

ffu, apenas 22.3% morreram. Todos os animais inoculados com as doses

mais baixas (1.0x10

ffu e 1.0x10

ffu) e com o mock sobreviveram (Figura 4.36).

A dose viral para inoculação foi determinada sendo 10

-2

(dois logs a menos)

do valor obtido pelo ensaio de DL

, como descrito anteriormente em DESPRÈS et

al. 1998. Portanto, baseado nas porcentagens de mortalidade dos animais

inoculados com pBACDV1, ficou estabelecida a dose de 1.0x10

2,75

ffu para

Figura 4.36 – Representação gráfica da sobrevivência dos animais inoculados

i.c. com pBACDV1, no ensaio de DL

. Os animais foram acompanhados por 21

dias.

1.0x10

ffu

1.0x10

ffu

1.0x10

ffu

1.0x10

ffu

mock

129

inoculação dos vírus recombinantes nos ensaios da avaliação do potencial papel das

mutações no processo de neuropatogênese.

Os vírus recombinantes, o pBACDV1 e o mock foram inoculados i.c. em

camundongos Swiss neonatos com a dose estabelecida, e os animais foram

observados por um período de 21 dias para análises de morbidade e mortalidade

(Figura 4.37).

Os grupos de animais inoculados com mock, pBACDV1, e com os vírus

contendo as mutações E402, E405, NS3-209 e E402/NS3-209 exibiram

comportamento normal durante o período analisado. Entretanto, todos os animais

inoculados com os vírus NS3-435, NS3-480, E405/NS3-435 e E402/NS3-480

desenvolveram sintomas similares aos das cepas neurovirulentas FGA/NA-d1d e

FGA/NA-P6, como sinais de encefalite e paralisia parcial dos membros inferiores,

iniciando entre os dias 9 e 10 pós-inoculação.

As taxas de mortalidade mostraram que 27% dos animais inoculados com o

vírus NS3-435 morreram, enquanto os demais animais do mesmo grupo se

recuperaram completamente dos sinais de doença após 21dpi. Já 51% dos animais

inoculados com o vírus NS3-480 morreram em consequência da doença (Figura

4.37). Estes resultados sugerem o papel destas mutações no fenótipo de

neurovirulência viral em camundongos. Além disso, no grupo de animais inoculado

com o vírus contendo as mutações E405/NS3-435, apenas 29% sobreviveram (taxa

de mortalidade próxima de 70%), enquanto o vírus E402/NS3-480 foi responsável

pela morte de 100% dos animais (Figura 4.37), evidenciando um efeito sinérgico das

mutações na doença e morte dos animais.

Estes resultados evidenciam que, as mutações E402 e E405 quando

ensaiadas de forma isolada, não foram suficientes para causar doença ou morte dos

animais, mas quando combinadas com as mutações da proteína NS3,

desempenham um papel importante desencadeando doença neurológica e morte.

Outro dado interessante é observado nas taxas de mortalidade dos vírus

recombinantes E405/NS3-435 e E402/NS3-480, que seguem o mesmo padrão de

cepas neuroadaptadas, FGA/NA-d1d e FGA/NA-P6 (Figura 4.37).

130

4.8 Exclusão de possível contaminação com vírus da encefalomielite

murina de Theiler no sistema nervoso central de camundongos por PCR em

tempo real

O vírus da encefalomielite murina de Theiler (TMEV) é um patógeno entérico

de camundongos, pertencente ao gênero Cardiovirus da família Picornaviridae

(RUECKERT, 1996), que possui cepas neurovirulentas (GDVII e FA) que induzem

uma encefalite aguda e fatal, e cepas de baixa virulência (TO, WW, DA e BeAn) que

persistem no sistema nervoso central, induzindo doença crônica, caracterizada por

desmielinização (LIPTON, 1975).

Com o intuito de descartar uma eventual contaminação dos animais com

outro vírus encefalítico, foram realizadas reações de amplificação por qPCR, com

oligonucleotídeos específicos para TMEV, que é um contaminante freqüente em

biotérios de experimentação, e para o qual, o teste estava disponível em nosso

laboratório. As reações de qPCR foram realizadas a partir de amostras de RNAs

extraídas dos tecidos cerebrais dos camundongos infectados com 8dpi. Como

Figura 4.37 – Representação gráfica da sobrevivência dos animais inoculados com

os vírus recombinantes e controles ao longo de 21 dias. Os camundongos infectados

via i.c., foram observados por 21 dias.

131

controle da reação foi utilizado o RNA de uma amostra positiva, denominada

MR/NA-P6.

A Figura 4.38A mostra a lista contendo o resultado das informações geradas

pelo programa com a identificação da amostra, o detector utilizado, tipo de amostra

e o valor de Ct para cada amostra ensaiada. A amostra MR/NA-P6 foi classificada

como controle positivo, a reação com água (branco) como controle negativo e as

demais amostras como “não conhecido”. O resultado, expresso em valor de Ct, se

refere ao número de ciclos de PCR necessários para que o sinal o fluorescente

atinja o limiar de detecção. O valor de Ct foi indeterminado para todas as amostras

analisadas, portanto negativo para infecção por TMEV. Os resultados são também

facilmente visualizados pelos gráficos gerados no programa. A Figura 4.38B mostra

a amplificação dos produtos em um gráfico que representa a intensidade de

fluorescência relativa (delta Rn) em cada ciclo da PCR, onde é possível observar

apenas a curva de amplificação do controle positivo MR/NA-P6, sendo as demais

amostras negativas.

Figura 4.38 – Resultado da amplificação por

qPCR para TMEV nas amostras dos vírus

recombinantes e das cepas neuroadaptadas

FGA/NA-P6 e FGA/NA-d1d. A – Lista contendo o

resultado das informações geradas pelo programa

com a identificação da amostra, o detector

utilizado, tipo de amostra e o valor de Ct para cada

amostra ensaiada. B – Representação gráfica da

amplificação dos produtos, onde o eixo x do

gráfico representa a intensidade de fluorescência

relativa (delta Rn) e o eixo y o ciclo da PCR.

132

4.9 Análise das taxas de replicação viral dos vírus recombinantes no

SNC de camundongos por PCR em tempo real

A fim de identificar e quantificar o RNA viral presente no tecido cerebral de

camundongos infectados foram realizadas reações de amplificação por qPCR, com

oligonucleotídeos específicos para DENV1, a partir de amostras de RNAs extraídas

de tecidos do SNC de camundongos infectados com 8dpi. Os dados da amplificação

do RNA viral foram normalizados utilizando-se o gene de expressão constitutiva

gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase de Mus musculus (murGAPDH).

Os valores obtidos foram utilizados para gerar um gráfico em logaritmo para

uma melhor visualização dos dados. Na Figura 4.39 é possível observar que os vírus

contendo as duplas mutações E402/NS3-480 e E405/NS3-435 apresentaram as

maiores taxas de replicação viral no cérebro dos animais, quando comparados com

as demais amostras, o que corrobora os resultados das taxas de mortalidade

observadas nos ensaios in vivo.

Figura 4.39 – Representação gráfica da amplificação do RNA viral por

qPCR dos vírus recombinantes e das cepas neuroadaptadas FGA/NA-P6 e

FGA/NA-d1d. Os resultados foram normalizados com a quantificação do

gene murino GAPDH (murGAPDH).

AMOSTRAS

RNA viral / mRNA murGAPDH (log)

133

4.10 Análise do perfil da expressão gênica no SNC de camundongos

infectados com vírus recombinantes por PCR em tempo real

Dados anteriores do grupo (BORDIGNON et al., 2008) revelaram o perfil da

expressão gênica de vias diferencialmente expressas durante a infecção do SNC de

camundongos com cepas neurovirulentas. Portanto, baseado nos dados obtidos

previamente e com a finalidade de analisar e comparar o perfil da expressão gênica

no tecido cerebral de camundongos infectados com os vírus recombinantes gerados

neste estudo, foram escolhidos alguns genes representantes de vias previamente

identificadas: sinalização de interferon (Irf1 – interferon regulatory factor), interferon

alfa e beta, apresentação de antígeno (Psmb8 – proteosome subunit beta type 8),

ubiquitinação de proteína (Usp18 – ubiquitin specific protease 18), complemento

(C1r – component 1, r subcomponent), e quimiocinas (Ccl5 – ligante de quimiocina 5

– motivo C-C). Os dados da amplificação dos mRNAs dos genes foram normalizados

utilizando-se o gene de expressão constitutiva murGAPDH e a modulação dos

genes foi calculada em relação ao vírus pBACDV1 (ver cálculo no item 3.4.5) (Figura

4.40).

134

A linha preta marca o limiar entre a expressão gênica de pBACDV1 (1x

modulado) em relação às demais amostras. É possível observar que, de uma

maneira geral, a modulação da expressão gênica é maior na infecção com os vírus

neuroadaptados (FGA/NA-d1d e FGA/NA-P6) e com os vírus duplo-mutantes

E402/NS3-480 e E405/NS3-435.

Figura 4.40 – Quantificação da modulação de genes diferencialmente expressos durante a infecção

do SNC de camundongos com os vírus recombinantes gerados neste trabalho. No eixo x estão

indicadas as amostras, e no eixo y, o valor da modulação dos genes normalizados com gene

murGAPDH, expresso em número de vezes que o gene está aumentado para cada amostra. As

linhas pretas delimitam a expressão dos genes para pBACDV1 em relação às demais amostras.

135

4.11 Análise histopatológica e imunohistoquimica do tecido cerebral dos

camundongos infectados com vírus recombinantes

Para avaliar o comprometimento do SNC durante a infecção pelos vírus

recombinantes, foram analisados o cérebros dos animais infectados, que foram

coletados com 10 dpi, quando os animais começaram a apresentar sinais de doença

e envolvimento do SNC, e foram imediatamente fixados por imersão em solução

10% formalina. Foi realizada a coloração com hematoxilina-eosina, para análise

morfológica dos danos nos tecidos (Figura 4.43), e a marcação com anticorpo

monoclonal anti-E, 4G2 flavivirus-específico, para a localização do antígeno viral nos

tecidos (Figura 4.44).

A Figura 4.41 ilustra as regiões do cérebro, destacando em vermelho as

regiões onde foram encontrado danos no tecido e marcação de proteína viral com

anticorpo monoclonal nos cérebros dos camundongos infectados, quando analisado

por histologia. Em verde, está representada a área do córtex frontal onde é realizado

o inóculo dos vírus.

Figura 4.41 – Ilustração das regiões do cérebro e local de

inoculação dos vírus. A região do hipocampo está

internalizada e a seta aponta apenas a direção.

136

A análise do material revelou que todas as amostras infectadas com vírus

apresentaram meningite, moderada a aguda, e os critérios que caracterizam

encefalite, sendo graduada em discreta, moderada ou acentuada, de acordo com

seu grau de comprometimento (Quadro 4.2). Os critérios que caracterizam uma

encefalite são: necrose neuronal (neurônio vermelho), cerebrite (infiltrado

mononuclear em vasos) e nódulo microglial, e estão representados na Figura 4.42.

Quadro 4.2 – Classificação da lesão observada no tecido cerebral dos camundongos

infectados com os diferentes vírus, de acordo com o grau de comprometimento.

137

Além dos vírus FGA/NA-P6 e FGA/NA-d1d, anteriormente caracterizados e

sabidamente neuropatogênicos, as secções do cérebro dos camundongos

infectados com os vírus NS3-435, NS3-480, E402/NS3-480 e E405/NS3-435

apresentaram um grande comprometimento do SNC, atingindo principalmente

neurônios motores e de equilíbrio, localizados nos córtices frontal e temporal. Estes

Figura 4.42 – Histopatologia do córtex fronto-parietal do SNC de camundongos,

destacando os critérios que caracterizam o quadro de encefalite, lâminas coradas

com hematoxilina-eosina. A – Secção do cérebro do camundongo inoculado com

mock, (1) meninge, (2) neurônios saudáveis, (3) vaso sanguíneo saudável. B a E –

Secções de cérebros de camundongos infetados com vírus dengue recombinantes,

(I) meningite moderada, (II) necrose neuronal (neurônio vermelho), (III) cerebrite

(infiltrado mononuclear ao redor de vasos), (IV) nódulo microglial, (V) hiperplasia

microglial. Aumento de 400x e barras equivalentes a 50!m.

138

dados coincidem com o período de aparecimento de doença nos animais infectados

com os mesmos vírus (ver item 4.7).

continua na próxima página…

139

Figura 4.43 – Histopatologia do SNC de camundongos inoculados com vírus

recombinantes, áreas da meninge, córtex frontal e córtex temporal. (M) meninge, (IM)

infiltrado mononuclear, (C) cerebrite, (NV) neurônio vermelho, (NS) neurônio sadio.

Aumentos de 400x, barra equivalente a 70!m.

140

continua na próxima página…

141

Figura 4.44 – Análises por imunohistologia do SNC de camundongos inoculados com vírus

recombinantes. As flechas apontam algumas células marcadas. Aumentos de 200x, barra

equivalente a 150!m. Aumentos de 400x, barra equivalentes a 70!m.

142

4.12 Construção de novos clones contendo aminoácidos de diferentes

famílias na posição NS3-480

Observando os resultados obtidos, é possível inferir que a mutação NS3-480

possui um papel importante no processo de neurovirulência em cepas virais

neuroadaptadas. Sendo assim, na tentativa de definir a importância da característica

do aminoácido no processo de neurovirulência, foram gerados 10 novos clones

substituindo a mutação NS3-480 por outros aminoácidos com diferentes

características de carga e índices de hidrofobicidade (Tabela 3.12 – item 3.5).

O DNA do clone infeccioso pBACDV1 serviu como molde para a síntese dos

fragmentos contendo as mutações, pela amplificação por PCR de fusão, seguindo

mesmo protocolo já descrito para os demais clones (ver item 4.2).

As Figuras 4.45 e 4.46 mostram o perfil eletroforético das amplificações,

referentes a cada mutação, sendo o tamanho de cada fragmento correspondente ao

esperado.

Quadro 4.3 – Compilação resumida dos resultados obtidos com os clones construídos neste

trabalho, com o respectivo esquema da localização de cada mutação.

143

Os novos fragmentos NS3-480 fusionados foram purificados e digeridos com

as endonucleases de restrição BsiWI e NheI. O fragmento de interesse de 1.604pb

foi purificado por excisão de gel de agarose (Figura 4.47). O clone pBACDV1

previamente digerido com as mesmas enzimas (Figura 4.5 – item 4.2) foi utilizado

como vetor.

Figura 4.45 – Eletroforese em gel de agarose 0,8% das amplificações dos novos

fragmentos mutados NS3-480. 1Kb+ – marcador de peso molecular 1Kb plus

(Invitrogen), A – fragm A, B – fragm B, para cada estratégia de mutação.

Figura 4.46 – Eletroforese em gel de agarose 0,8% das amplificações por PCR de

fusão dos novos fragmentos mutados NS3-480. 1Kb+ – marcador de peso

molecular 1Kb plus (Invitrogen).

144

Cada fragmento de DNA foi utilizado para clonagem no clone pBACDV1 pela

substituição da região correspondente, seguindo protocolo da enzima T4 DNA

ligase. As ligações foram utilizadas para transformar bactérias TOP10 cálcio-

competentes. As colônias resultantes foram transferidas para uma nova placa

numerada para identificação dos possíveis clones. Algumas colônias de cada clone

foram submetidas à triagem através da técnica de PCR de colônia (dado não

mostrado) e posterior digestão com a endonuclease de restrição BsaBI para

confirmação de prováveis clones (Figura 4.48).

Figura 4.47 – Eletroforese em gel de agarose 0,8% das digestões BsiWI/NheI

dos fragmentos contendo as novas mutações NS3-480. 1Kb+ – marcador de

peso molecular 1Kb plus (Invitrogen).

145

Aproximadamente 79% das colônias testadas foram confirmadas por

digestão. A partir disso, foram escolhidas algumas colônias dos clones Thr, Val, Glu

e Arg para confirmação por sequenciamento e continuidade do trabalho. As colônias

foram amplificadas e sequenciadas com a mesma estratégia já utilizada para o clone

NS3-480 (item 4.2 – dado não mostrado). A escolha dos aminoácidos foi baseada

nas características de cada um (ver Tabela 3.12 – item 3.5). Para tanto, foram

Figura 4.48 – Eletroforese em gel de agarose 0,8% da digestão confirmatória dos

PCRs de colônia dos novos clones NS3-480 com endonuclease de restrição BsaBI.

1Kb+ – marcador de peso molecular 1Kb plus (Invitrogen), CO- – controle negativo

(digestão das amplificações de colônias crescidas da clonagem do vetor sem inserto).

146

escolhidos dois aminoácidos semelhantes ao já estudados, como a treonina (Thr)

que é polar e nucleofílico, semelhante a serina do vírus neuroadaptado FG/NA-P6, e

a valina (Val) que é apolar e hidrofóbico, como a leucina no vírus pBACDV1. Os

outros aminoácidos foram escolhidos por possuírem característica bem diferentes,

como o acido glutâmico (Glu), por ser ácido e carregado negativamente, e arginina

(Arg), por ser básico e carregado positivamente. A Figura 4.49 mostra as estruturas

químicas destas moléculas.

Após o sequenciamento, não foi identificado nenhum clone Thr contendo a

sequencia correta, sem mutações extras. Os clones das outras mutações que

continham sua sequencia correta, foram identificados como: 480Val_cl.9,

480Glu_cl.40 e 480Arg_cl.75. As minipreps de DNA destes clones (Figura 4.50A)

foram linearizadas pela digestão com a enzima de restrição SwaI, de acordo com os

tampões e condições descritas pelo fabricante. Em seguida, as reações eram

purificadas pela extração com fenol e precipitação com etanol (Figura 4.50B). As

amostras de DNA clivadas foram utilizadas como molde para reações de síntese de

RNA, utilizando o kit de transcrição in vitro T7 MEGAscript, com adição de cap.

Figura 4.49 – Estrutura química dos aminoácidos escolhidos para clonagem

na posição NS3-480.

147

Os RNAs recombinantes transcritos (Figura 4.50C) foram utilizados para

transfecção em células de inseto C6/36 utilizando protocolo com lipofectina, como já

descrito anteriormente (ver item 4.3.3). Os sobrenadantes foram recolhidos com 120

horas pós transfecção, aliquotados e armazenados a –70°C para sua posterior

titulação.

Foram obtidos os títulos 2.5x10

ffu/mL para Val_cl.9, 3.7x10

ffu/mL para

Glu_cl.40 e 3.25x10

ffu/mL para Arg_cl.75. Estes vírus recombinantes estão sendo

amplificados em culturas de células C6/36 (como descrito no item 4.3.4) para

purificação em gradiente de sacarose, inoculação em camundongos Swiss e análise

de fenótipo in vivo.

Figura 4.50 – Eletroforeses em gel de agarose 0.8% dos novos clones

NS3-480. A – Minipreps. B – Digestões SawI. C – RNAs resultantes das

transcrições in vitro.

148

5. DISCUSSÃO

Apesar dos recentes avanços no conhecimento da biologia do vírus da

dengue, resultado de estudos das proteínas virais e dos mecanismos de replicação

e tradução, a patogênese relacionada à infecção por DENV continua sendo um

desafio, principalmente pela falta de um modelo animal que desenvolva a doença

de forma similar ao homem (CLYDE; KYLE; HARRIS, 2006).

Sabe-se que a infecção por qualquer um dos quatro sorotipos da dengue

pode causar desde quadros assintomáticos até quadros graves da doença, com

eventos hemorrágicos, podendo resultar em óbito. Porém, os achados clínicos da

doença têm se modificado nos últimos anos, e o aparecimento de episódios de

encefalite associados à infecção com o vírus da dengue vêm aumentado

significativamente (SUMARMO et al., 1978; LUM et al., 1996; HOMMEL et al., 1998;

RAMOS et al., 1998; SOLOMON et al., 2000; CAM et al., 2001; NOGUEIRA et al.,

2002; MALAVIGE et al., 2004; MIAGOSTOVICH et al., 2006; DOMINGUES et al.,

2007). Alguns dos possíveis mecanismos sugeridos para explicar a patogênese

neurológica na infecção pelo DENV seriam, a invasão direta do SNC pelo vírus, a

ocorrência de danos sistêmicos indiretos, reações autoimunes secundárias à

infecção sistêmica, ou ainda, ocorrência de episódios de trombocitopenia seguidos

de hemorragia cerebromeningeal (RAMOS et al., 1998; PUCCIONI-SOHLER et al.,

2009). Acredita-se que os flavivírus atravessem a barreira hematoencefálica por

transporte passivo através do endotélio, pela replicação ativa nas células endoteliais,

ou pelo mecanismo de “Cavalo de Tróia”, pelo qual os vírus são carregados para

dentro do cérebro por células inflamatórias infectadas, e assim infectem células do

SNC. Porém, o mecanismo específico pelo qual os vírus da dengue atravessam

essa barreira ainda não está totalmente compreendido, e qualquer que seja o

mecanismo envolvido no rompimento da barreira hematoencefálica, representa um

evento-chave na patogênese da encefalite causada por flavivírus (DIAMOND, 2003;

MISHRA et al., 2009).

Uma abordagem para melhor entender a neuropatologia da dengue, seria

determinar quais sequências ou estruturas virais estariam envolvidas na virulência,

comparando o genoma viral completo, amplificado diretamente de amostras

biológicas de pacientes com diferentes quadros clínicos da doença, incluindo os

149

neurológicos. Inúmeros trabalhos têm sido realizados nos últimos anos no sentido de

identificar alterações genéticas que possam estar relacionadas ao aumento da

gravidade dos casos de dengue. A primeira evidência da presença de determinantes

genéticos associados à maior gravidade nos casos de dengue foi identificada em

estudos com cepas de DENV2, indicando que o genótipo asiático está mais

associado à doença grave em relação ao genótipo americano (RICO-HESSE et al.,

1997). Leitmeyer et al. (1999) estudaram o genoma completo de 11 amostras de

DENV2, associados à DF ou DHF. Foram observadas seis diferenças na sequência

de aminoácidos dos genes que codificam as proteínas prM, E, NS4B e NS5, porém

não havia associação direta destas mutações com a gravidade da doença. Um

possível determinante de virulência foi identificado na posição 390 da proteína de

envelope, já que alterações nesta posição, que está envolvida com a ligação a

receptores na célula hospedeira (CHEN; MAGUIRE; MARKS, 1996), endocitose

mediada por receptor, tropismo celular e estímulo à produção de anticorpos

neutralizantes (CHAO et al., 2005), aumentam a neurovirulência do DENV2 em

camundongos recém-nascidos (SÁNCHEZ; RUIZ, 1996). Muitos trabalhos têm

comparado as sequências de isolados de DENV obtidos de pacientes que

apresentaram doença grave (DHF/DSS) com outros isolados de casos de DF. A

maioria identifica variações genéticas entre os isolados, mas não diferenças

consistentes na sequência, que sejam marcadores moleculares de gravidade de

doença (MANGADA; IGARASHI, 1998; PANDEY; IGARASHI, 2000; UZCATEGUI et

al., 2001; AQUINO et al., 2006).

Inúmeros trabalhos descrevendo casos de pacientes com manifestações

neurológicas relacionadas à infecção por DENV têm sido relatados, mas até o

momento não foi realizada a caracterização genética completa do DENV a partir

deste material e, portanto nenhum marcador molecular de neurovirulência foi

determinado. A abordagem normalmente utilizada é a identificação de anticorpos

contra dengue no soro e fluído cerebroespinhal desses pacientes, ou ainda o

protocolo de isolamento viral para determinação do sorotipo infectante (PATEY et

al., 1993; ROW; WEINSTEIN; MURRAY-SMITH, 1996; SOLOMON et al., 2000;

KANKIRAWATANA et al., 2000; NOGUEIRA et al., 2005; GARCIA-RIVERA;

VORNDAM; RIGAU-PÉREZ, 2009).

Na ausência de determinantes genéticos caracterizados que estejam

relacionados à neuropatologia da dengue em humanos e visando compreender

150

melhor a patogênese dessa doença, Desprès et al. (1998) e Bordignon et al. (2007),

utilizando um modelo murino, geraram variantes de DENV1 altamente

neurovirulentas, FGA/NA-d1d, FGA/NA-a5c e FGA/NA-P6, que se replicam

eficientemente no SNC de camundongos. Os determinantes genéticos

potencialmente responsáveis pelo fenótipo neurovirulento dessas variantes foram

identificados pelo sequenciamento completo do genoma das cepas virais e mapeiam

nas proteínas E e NS3 do vírus da dengue (Quadro 1.1) (DUARTE DOS SANTOS et

al., 2000; BORDIGNON et al., 2007).

Para confirmar o envolvimento das mutações identificadas por Duarte dos

Santos et al., 2000 e Bordignon et al., 2007 durante o processo de neuroadaptação,

e tentando compreender os mecanismos implicados no desenvolvimento de doença

neurológica nos animais, foram gerados, nesse trabalho, clones infecciosos

recombinantes contendo cada uma das mutações identificadas nas cepas

neuroadaptadas isoladamente ou em conjunto. Os clones foram construídos pela

inserção das mutações no clone infeccioso pBACDV1, construído a partir da cepa

DENV1 BR/90 (SUZUKI et al., 2007). Os vírus recombinantes gerados foram

avaliados quanto ao seu potencial de replicação em células de inseto, infectividade

no SNC de camundongos Swiss neonatos, indução de resposta imune no SNC dos

animais e perfil histopatológico do tecido cerebral considerando as lesões

ocasionadas pela infecção.

As cepas FGA/89 (cepa parental utilizada no estudo de neuroadaptação) e

BR/90 (utilizada na construção do clone infeccioso pBACDV1) possuem uma

diferença de 21 resíduos de aminoácidos na totalidade da poliproteína. A inserção

de mutações pontuais de uma cepa viral no contexto do genoma de outra cepa

distinta torna os resultados mais robustos, tendo em vista que, os resultados

observados reproduziram o fenótipo das cepas neuroadaptadas, o que reforça o

envolvimento destas mutações na neuropatogênese da dengue.

O clone infeccioso pBACDV1, utilizado para a construção dos vírus

recombinantes deste estudo, foi construído no BAC, um vetor de cópia única,

visando contornar o problema da instabilidade da clonagem desses genomas nos

sistemas bacterianos (YUN et al., 2003; PIERRO et al., 2006; SUZUKI et al., 2007).

O clone compreende a sequência completa do genoma da cepa BR/90 e possui

algumas características que visam o maior rendimento do RNA sintético no protocolo

de transcrição in vitro, como a sequência promotora T7 RNA polimerase, adicionada

151

de uma base G, imediatamente antes da região 5’NTR. A presença do nucleotídeo

extra parece estar associada a uma maior taxa de transcrição do que o A que

constitui o primeiro nucleotídeo dos genomas de flavivírus (RICE et al., 1989;

IMBURGIO et al., 2000); e a sequência da ribozima do vírus da hepatite delta, que

parece aumentar a eficiência de transfecção de 20 a 100 vezes quando comparada

à estratégia tradicional de linearização com endonuclease, seguida de tratamento

com exonuclease (ROSSI et al., 2005).

As mutações testadas nesse estudo foram identificadas no genoma viral das

variantes neuroadaptadas, FGA/NA-d1d e FGA/NA-P6, sendo as mutações E402

(Phe

402

Leu) e E405 (Thr

405

Ile), mapeadas na haste da proteína E, e as mutações

NS3-209 (Val

209

Ile), NS3-435 (Leu

435

Ser) e NS3-480 (Leu

480

Ser), no domínio

helicase da proteína NS3, sugerindo a participação dessas duas proteínas no

desenvolvimento do fenótipo de neurovirulência em camundongos. As demais

mutações que foram identificadas apenas na cepa FGA/NA-d1d (E196 e E365)

foram desconsideradas (BORDIGNON et al., 2007).

Outros trabalhos utilizando clones infecciosos do vírus da dengue,

relacionando neurovirulência em camundongos com a presença de mutações,

geralmente mapeiam na proteína E. Kawano et al. (1993) analisaram genomas

infecciosos quiméricos construídos pela clonagem da região estrutural de diferentes

cepas de DENV4 no esqueleto de uma variante não neurovirulenta. Os autores

identificaram um clone altamente neurovirulento, que continha as proteínas

estruturais de uma cepa sabidamente neurovirulenta de DENV4, indicando que essa

região estaria associada ao fenótipo. Nesse trabalho foram identificadas 2 mutações

localizadas na proteína E, Thr

155

Ile, que elimina um dos dois sitio de glicosilação de

E e Phe

401

Leu, ambas possivelmente relacionadas aos resultados observados nos

camundongos. Chen et al. (1995) estudaram, em um clone quimérico

DENV3/DENV4, o efeito de duas substituições na proteína E (Glu

406

Lys e

Thr

435

Leu), identificadas em DENV2 e DENV4, respectivamente, e que conferem

neurovirulência em camundongos. Experimentos de inoculação i.c. em

camundongos revelaram que a quimera mutante contendo a subtituição Glu

406

Lys,

que mapeia no mesmo domínio das cepas neurovirulentas deste estudo,

apresentava caráter neurovirulento, enquanto o vírus parental, não. Gualano et al.

(1998) construíram um clone infeccioso da cepa Nova Guiné C de DENV2

(MON501), altamente virulenta, e substituíram as proteína prM/E pelas de uma cepa

152

não neurovirulenta, também do sorotipo 2 (MON310). Os autores identificaram sete

mutações na região prM/E, sendo uma delas não-conservativa, no resíduo 126 da

proteína E (Glu

126

Lys). Foram inseridas substituições Glu

126

Lys e Lys

126

Glu nos

clones MON310 e MON501, respectivamente. As propriedades destes mutantes

demonstraram claramente que o resíduo Lys na posição 126 era o determinante da

neurovirulência em camundongos. Outro grupo identificou essa mesma substituição

Glu

126

Lys, que representa a mudança de um aminoácido negativamente carregado

por um positivamente carregado, como provável responsável por desempenhar um

papel importante na aquisição do fenótipo de neurovirulência em camundongos

(BRAY et al., 1998). Zhao et al. (2003) geraram duas variantes do clone MON501,

de DENV2, contendo as substituições Lys

Glu e Asn

203

Asp. Os vírus gerados a

partir desses clones foram utilizados para inocular camundongos neonatos via i.c.

Quando comparados com os animais inoculados com o vírus MON501, foi possível

observar que um número menor de animais apresentou sinais de encefalite e o

tempo de sobrevivência foi maior. Desse modo, os autores concluem que as

posições E62 e E203 estão diretamente ligadas ao desenvolvimento do fenótipo de

neurovirulência em camundongos. Lee e Lobigs (2000) construíram um clone

infeccioso de Encefalite de Murray Valley (MVE) e investigaram o impacto da

mudança de aminoácido na posição Asp

390

no tropismo celular, entrada do vírus e

virulência. Três vírus mutantes, Asp

390

Gly, Asp

390

Ala e Asp

390

His, demonstraram

diferenças em relação ao clone controle quando crescidos em células de mamífero e

de mosquito. Neste estudo, foram observadas alterações no tropismo celular

relacionadas à entrada do vírus na célula, aumento da dependência de

glicosaminoglicanos para a ligação dos vírus a células de mamíferos e diminuição da

virulência em camundongos. Estes resultados confirmam o papel funcional desta

região da proteína de Envelope na entrada do vírus e sugere que a entrada de

Flavivírus encefalíticos possa ocorrer via ligação a glicosaminoglicanos.

Muitos outros autores vêm demonstrando que mutações na proteína E do

vírus da dengue e outros Flavivírus podem modular a infectividade e virulência

desses vírus (HOLZMANN et al., 1990; HASEGAWA et al., 1992; SÁNCHEZ; RUIZ,

1996; RYMAN et al., 1997; LEITMEYER et al., 1999; MONATH et al., 2002;

GUIRAKHOO et al., 2004; ZHAO et al., 2005; ZHANG et al., 2006; BORDIGNON et

al., 2007; NICKELLS et al., 2008; PRESTWOOD et al., 2008; YU et al., 2008;

KROSCHEWSKI; SAGRIPANTI; DAVIDSON, 2009; TAJIMA et al., 2010). Dados

153

desses estudos indicam que normalmente estas mutações estão localizadas em três

regiões diferentes: na base do domínio II (resíduos 52-136 e 190-284), região que

atua como dobradiça durante a mudança conformacional fusogênica da proteína; na

região de contato entre a interface dos domínios I e III, que constitui o sítio de

dimerização ou trimerização dos monômeros da proteína E após o contato do vírus

com a membrana celular; ou ainda, na face distal do domínio III (resíduos 303-395),

que possui uma conformação tipo-IgG. Mutações nessa última, modificam a

capacidade do vírus se ligar à célula hospedeira, afetando a internalização viral ou o

tropismo celular (REY et al., 1995; SÁNCHEZ; RUIZ, 1996).

As mutações estudadas no presente trabalho, identificadas na proteína E

(Phe

402

Leu e Thr

405

Ile), estão localizadas na haste, em uma estrutura !-hélice

denominada H1

pred

, logo abaixo do domínio III, na porção C-terminal da proteína

(Figuras 1.7 e 4.1) (ALLISON et al., 1999). Todas as estruturas atômicas da proteína

E determinadas para os Flavivírus foram obtidas apenas para o ectodomínio da

proteína (domínios I, II e III), excluindo-se as regiões da haste e âncora

transmembrana, para as quais somente estruturas preditas, baseadas em

sequências nucleotídicas, estão disponíveis.

Muitos grupos vêm investigando o papel da haste da proteína E na formação

de homotrímeros, na interação com a proteína prM, formação de partículas e

retenção intracelular, utilizando clones quiméricos (ALLISON et al., 1999; CHANG et

al., 2003; PURDY; CHANG, 2005; HSIEH et al., 2008). Allison et al. (1999)

construíram uma série de clones truncados na região C-terminal e tentaram

determinar regiões específicas que seriam importantes na interação da proteína E

com prM, na formação de partículas virais e nas mudanças estruturais induzidas

pelo pH reduzido do meio. Os autores sugerem que o elemento H1

pred

participa na

formação da estrutura trimérica durante o processo de fusão de membranas. Clones

truncados desta sequência eram secretados na forma de dímeros que se

dissociavam em pH baixo, mas não chegavam a formar trímeros, enquanto clones

que possuíam deleções imediatamente após o elemento H1

pred

, foram capazes de

converter irreversivelmente a proteína E na forma de trímeros. Purdy e Chang (2005)

inseriram diversas mutações em um clone quimérico (prM/E), nas regiões H1

e H2

da haste de E, e identificaram três substituições de aminoácidos na !-hélice H1

(Ile

398

Leu, Met

401

Ala e Met

412

Leu) que aumentariam a secreção de VLPs. Além

disso, observaram que construções duplas ou triplas contendo essas mutações

154

estão associadas a um aumento na secreção de VLPs, quando comparadas com os

clones contendo apenas uma mutação. Em um outro estudo, com o vírus Langat

(LGTV), flavivírus transmitido por carrapatos, os autores compararam a

patogenicidade em camundongos da cepa parental TP21 com quatro cepas

variantes, que foram isoladas e caracterizadas como não ligantes à receptores de

membrana. Foram identificadas mutações na região da haste da proteína E das

cepas variantes (Leu

416

Ala, Asn

473

Lys, Val

440

Ala, His

438

Tyr) e ensaios de DL

camundongos demonstraram que todas as cepas variantes eram atenuadas

(HOLBROOK et al., 2001). Estudos com TBEV e WNV demonstraram o

envolvimento da região da haste na interação prM/E e a contribuição dessa

interação heterodimérica, assim como da N-glicosilação do resíduo 154 de WNV, na

produção de VLPs (ALLISON et al., 1999; HANNA et al., 2005). Hsieh et al. (2008)

geraram uma série de clones quiméricos prM/E (DENV2/JEV) para investigar os

mecanismos envolvidos na produção de VLPs por DENV2 e demonstraram que a

haste-âncora da proteína E de DENV2 continha um forte sinal de retenção no

retículo endoplasmático (RE), o que poderia contribuir para a produção ineficiente de

VLPs. Este dado foi apoiado por relatos recentes de que o domínio transmembrana

da proteína E dos vírus YFV e as proteínas E1 e E2 do vírus da hepatite C (HCV)

continham um sinal de retenção no RE (COCQUEREL et al., 1998, 1999; OP DE

BEECK et al., 2004).

Baseado nos dados descritos na literatura, a presença de mutações na região

pred

do vírus da dengue poderia facilitar o processo de trimerização e

consequentemente o processo de fusão de membranas e liberação do

nucleopcapsídeo no citoplasma das células, aumentar a secreção de novas

partículas virais para o exterior das células, e desta forma, alterar a patogenicidade

viral. Sendo assim, a presença dessas mutações poderia estar associada a um

processo de fusão de membranas mais eficiente e à liberação de um número maior

de nucleocapsídeos no citoplasma, desencadeando a tradução e replicação do

genoma viral em maior escala, e consequentemente na produção de mais progênie

viral, resultando em um aumento na virulência e patogenicidade da infecção.

A proteína NS3, juntamente com as demais proteína do CR, desempenha

função essencial na replicação do RNA viral (KAPOOR et al., 1995a; MATUSAN; et

al., 2001; LUO et al., 2008; BOLLATI et al., 2009). O papel-chave da atividade

helicase da NS3 na replicação viral foi demonstrado através de estudos de

155

mutagênese sítio-dirigida (GRASSMANN et al., 1999; MATUSAN et al., 2001;

SAMPATH et al., 2006). O domínio helicase da proteína NS3 parece ser responsável

por auxiliar na inicialização da síntese de moléculas de RNA simples fita de

polaridade negativa, (-)ssRNA, através do desenovelamento de estruturas

secundárias de RNA, permitindo assim o acesso da maquinaria de replicação

(TAKEGAMI et al., 1995; MATUSAN et al., 2001). Especula-se que a helicase

viabilize a montagem da maquinaria de replicação pelo estabelecimento das

estruturas de RNA das regiões 5’ e 3’NTR, além de auxiliar na liberação de fitas do

genoma viral recém-sintetizadas a partir de intermediários de replicação (WANG et

al., 2009). Mutações ao longo da sequência da proteína NS3 demonstraram efeitos

sobre a replicação viral e sobre as atividades ATPase e helicase in vitro (MATUSAN

et al., 2001). Liu, Chen e Khromykh (2003) avaliaram a importância das mudanças

de aminoácidos Tyr

518

His e Ser

557

Pro, do domínio helicase da NS3, utilizando um

sistema subgenômico de replicon do vírus Kunjin, na replicação viral e/ou na

montagem de partículas. Foi observado que a mutação Tyr

518

His era responsável

por um decréscimo na infectividade dos RNA transcritos e inibia a replicação viral,

enquanto a mudança Ser

557

Pro não apresentava nenhum efeito sobre a replicação.

Utilizando um sistema subgenômico de replicon e o clone infeccioso de febre

amarela, Patkar e Kuhn (2008), ao estudarem a mutação Trp

394

Ala no domínio

helicase da NS3, observaram um bloqueio na produção de partículas virais

infecciosas, sugerindo um papel ainda desconhecido dessa proteína nesse

processo, uma vez que essa mutação não teve efeito sobre a replicação viral.

Apesar dos diversos estudos, relativamente pouco se sabe sobre o mecanismo de

atuação das helicases dos Flavivírus, como por exemplo sua polaridade de

desenovelamento das fitas, a especificidade de substrato de fita dupla, ou ainda a

processividade da enzima (WANG et al., 2009).

A mutação NS3-209 (Val

209

Ile), estudada no presente trabalho, está

localizada entre os motivos Walker A e Walker B, do subdomínio 1, na região N-

terminal da helicase (Figuras 1.8 e 4.2). Esses motivos estão relacionados com

funções de interação com substratos de NTP e ligação a Mg

, respectivamente.

Bordignon et al. (2007) analisaram o alinhamento da sequência de aminoácidos do

domínio helicase da NS3 abrangendo essa região, e observaram a presença de uma

Ile na posição correspondente a 209 da proteína NS3 de DENV1 nos vírus JEV,

156

WNV e TBEV (XU et al., 2005), todos pertencentes ao grupo de vírus que causam

encefalite.

As demais mutações estudadas, NS3-435 (Leu

435

Ser) e NS3-480 (Leu

480

Ser),

estão localizadas no subdomínio 2 da helicase, logo após os motivos V e VI,

respectivamente (Figuras 1.8 e 4.2). Essa região está envolvida na ligação da

proteína ao RNA e hidrólise de ATP e é requerido para a movimentação da helicase

ao longo de substratos de ácido nucléico (TUTEJA; TUTEJA, 2004). De acordo com

resultados obtidos por Duarte dos Santos et al. (2000) a mutação NS3-435 aumenta

a habilidade de replicação do vírus in vitro. Da mesma forma que para mutação

NS3-209, o alinhamento da sequência de aminoácidos do subdomínio 2 identificou

um resíduo Ser na posição correspondente a NS3-480 de DENV1 nos vírus JEV e

YFV (cepa 17D, neurovirulenta) (XU et al., 2005), sugerindo uma relação entre a

presença desse resíduo e o caráter encefalítico da cepa viral. Além disso, um estudo

demonstra a interação da helicase de dengue com a proteína NS4b, sugerindo que

esta interação module a replicação viral (UMAREDDY et al., 2006).

Baseado nos relatos da literatura e resultados prévios de nossa equipe,

podemos inferir que as mutações identificadas na proteína NS3 de DENV1, estariam

afetando a atividade da helicase, requerida nas funções replicativas do vírus,

aumentando a eficiência da replicação, seja pela função direta desta mutação no

genoma ou pela interação da proteína com outras proteínas virais e,

consequentemente, resultando na síntese de um número maior de moléculas de

RNA, o que levaria ao aumento da progênie viral e agravamento da infecção.

Os vírus recombinantes gerados neste trabalho foram inicialmente avaliados

quanto à sua habilidade de causar efeito citopático (CPE) em culturas de células de

inseto C6/36 (Figura 4.34). Sabe-se que algumas cepas de DENV são capazes de

produzir CPE em cultura como por exemplo, fusão celular tipo-sincício, lise ou ainda

a inibição do crescimento celular, porém, os mecanismos envolvidos neste processo

e os fatores que determinam qual cepa viral desencadeia qual tipo de CPE ainda

são desconhecidos. Randolph e Stollar (1990) sugeriram que a formação de fusão

tipo-sincício em células de mosquitos infectadas com DENV pode ser iniciada por

virions recém liberados, que se tornam engajados na fusão com a membrana

plasmática de células vizinhas infectadas ou não. As variantes neuroadaptadas,

FGA/NA-d1d e FGA/NA-P6, assim como sua cepa parental, FGA/89, não são

capazes de produzir CPE em culturas de C6/36, sendo visualmente indistinguíveis

157

das culturas infectadas com mock. No entanto, o vírus gerado a partir do clone

pBACDV1 (cepa BR/90) desencadeia uma intensa fusão celular em culturas

(DESPRÈS; FRENKIEL; DEUBEL, 1993). Nas infecções com os vírus

recombinantes gerados nesse trabalho, foi possível observar o aparecimento de

fusão celular em quase todas as amostras, similar ao pBACDV1, exceto com os

vírus contendo as substituições E405 (Thr

405

Ile) e E405/NS3-435

(Thr

405

Ile/Leu

435

Ser), que não apresentaram CPE, semelhante ao vírus FGA/NA-d1d,

a partir do qual essas mutações foram inicialmente identificadas. Interessantemente,

o vírus contendo apenas a mutação NS3-435 apresenta fusão celular, mas quando

combinado com a mutação E405, deixa de apresentar esse efeito, sugerindo que

essa mutação desempenhe um papel importante na alteração do fenótipo em cultivo

celular. Estudos complementares serão necessários para determinar o potencial

papel e importância da mutação E405 no processo de inibição do efeito citopático

em culturas de células.

A falta de um modelo animal não-humano que seja susceptível à infecção

pelo vírus da dengue impulsiona o desenvolvimento de diferentes linhagens murinas,

e embora vários modelos murinos tenham sido relatados, nenhum é capaz de refletir

todo espectro da doença (BENTE; RICO-HESSE, 2006; SHRESTA et al., 2006;

VASILAKIS; WEAVER, 2008). Alguns estudos sugerem que, embora linhagens de

camundongos de laboratório sejam permissivas à infecção e replicação do vírus da

dengue, não são observados sinais clínicos evidentes, e cepas selvagens do vírus

replicam em níveis muito baixos, praticamente indetectáveis. Para superar esta

barreira, são utilizadas doses muito altas de vírus (até 1x10

pfu), cepas adaptadas

em modelo murino ou ainda inoculação pela via intracraniana (BENTE; RICO-

HESSE, 2006). No entanto, dados de um estudo comparativo que avaliou a

neurovirulência de vacinas quiméricas (ChimeriVax-JE e ChimeriVax-DEN1)

utilizando o modelo de primatas não humanas e um modelo murino (camundongos

ICR inoculados por via i.c.), concluiu que o modelo murino era mais sensível para

detectar diferenças na virulência das vacinas e que, portanto, poderia eventualmente

substituir o teste em primatas não humanos (MONATH et al., 2005).

Na tentativa de avaliar o papel das mutações, optamos por utilizar o modelo

experimental desenvolvido por Desprès et al. (1998), a fim de comparar in vivo os

vírus recombinantes gerados nesse trabalho com as variantes neuroadaptadas,

previamente descritas (FGA/NA-d1d e FGA/NA-P6). Esse protocolo consistia na

158

inoculação por via i.c. de camundongos Swiss neonatos com os vírus gerados a

partir dos clones recombinantes seguido de 21 dias de observação. A cepa BR/90,

que serviu de molde para construção do clone infeccioso pBACDV1, é um isolado

clínico do Rio de Janeiro de 1990 (DESPRÈS; FRENKIEL; DEUBEL, 1993), que foi

amplificado em laboratório por passagens sucessivas em culturas de células de

inseto, nunca tendo sido inoculada em camundongos durante esse processo. Assim,

antes de dar início aos experimentos animais, foi realizado um ensaio de DL

para

determinar a dose a ser utilizada para inocular os animais, já tendo sido

demonstrado previamente que a cepa BR/90 é mais neurovirulenta do que a FGA/89

(DESPRÈS; FRENKIEL; DEUBEL, 1993; DESPRÈS et al., 1996). No ensaio de

, foi constatado que, em doses mais elevadas (1x10

– 1x10

ffu), o vírus era

naturalmente neurovirulento, e portanto, estabeleceu-se a dose inicial como sendo

de 2 logs abaixo do valor de DL

50,

como descrito anteriormente por Desprès et al.,

1998. Nessa dose, o vírus do clone pBACDV1 não era capaz de causar sinais de

encefalite nos animais, enquanto as variantes neuroadaptadas, FGA/NA-d1d e

FGA/NA-P6, inoculadas com a mesma dose, resultavam em morte. Ao analisarmos

os animais inoculados com os vírus recombinantes, pudemos observar que os

grupos inoculados com os vírus NS3-435 (Leu

435

Ser), NS3-480 (Leu

480

Ser),

E405/NS3-435 (Thr

405

Ile/Leu

435

Ser) e E402/NS3-480 (Phe

402

Leu/Leu

480

Ser),

desenvolviam sintomas similares aos das cepas neurovirulentas, como sinais de

encefalite e paralisia parcial dos membros inferiores, enquanto os grupos de animais

inoculados com mock, pBACDV1, E402 (Phe

402

Leu), E405 (Thr

405

Ile), NS3-209

(Val

209

Ile) e E402/NS3-209 (Phe

402

Leu/Val

209

Ile) não apresentaram nenhum sinal de

doença. Dentre os grupos de animais que desenvolveram doença, foi constatado

que 27% dos animais inoculados com NS3-435 (Leu

435

Ser) e 51% dos inoculados

com NS3-480 (Leu

480

Ser) sucumbiram à doença (Figura 4.37), sugerindo que estas

mutações desempenhem um papel importante no desencadeamento do fenótipo de

neurovirulência viral em camundongos. No entanto, para comprovar o papel exato

dessas mutações, serão necessários estudos complementares visando confirmar a

importância do caráter dos aminoácidos nessas posições. Outro dado interessante

foi observado nos grupos de animais inoculados com os vírus E405/NS3-435

(Thr

405

Ile/Leu

435

Ser) e E402/NS3-480 (Phe

402

Leu/Leu

480

Ser), que foram

responsáveis pela morte de 70% e 100% dos animais, respectivamente,

evidenciando um efeito sinérgico dessas mutações. Esses resultados demonstram

159

que, mesmo que as mutações E402 (Phe

402

Leu) e E405 (Thr

405

Ile) isoladas não

sejam suficientes para causar doença ou morte dos animais, quando combinadas

com as mutações da proteína NS3, desempenham um papel importante

desencadeando doença neurológica e morte.

Dados da literatura e experiências prévias do nosso grupo apontam a

importância da utilização de camundongos neonatos em ensaios de

neuropatogênese por dengue, devido ao seu sistema imune ainda não estar

completamente maduro (DESPRÈS; FRENKIEL; DEUBEL, 1993; DESPRÈS et al.,

1998). Baseado neste dado, experimentos complementares foram realizados com o

intuito de observar o possível efeito desses vírus em animais adultos jovens ou

ainda, avaliar a rota de inoculação em animais neonatos, utilizando a mesma dose

determinada anteriormente. Para tanto, grupos de camundongos Swiss com

aproximadamente 6 semanas de vida foram inoculados i.c. com mock e com os vírus

pBACDV1 e NS3-480 (Leu

480

Ser). Outros três grupos de camundongos Swiss

neonatos foram inoculados com as mesmas amostras, porém, por via intraperitoneal

(i.p.). Os animais foram acompanhados por 21 dias e, durante esse período, nenhum

dos camundongos, adultos ou neonatos, desenvolveu qualquer sintoma de doença,

perda de peso ou mudança comportamental. Esse dado sugere que não houve

replicação viral no cérebro nos animais adultos, provavelmente pela ação de seu

sistema imune maduro no combate à infecção, e que o vírus não foi capaz de

atravessar a barreira hematoencefálica dos animais neonatos. Estudos mais

aprofundados serão realizados para confirmar estes achadaos.

Diferenças na gravidade da infecção por dengue podem ser observadas entre

indivíduos ou ainda entre populações (COFFEY et al., 2009). Sendo a dengue uma

doença multifatorial, a resposta imune do hospedeiro desempenha um importante

papel no desenvolvimento da doença, portanto, a habilidade do vírus escapar desta

resposta imune é crucial para o sucesso da infecção. Após a detecção da infecção

viral, as células iniciam imediatamente uma resposta antiviral mediada por interferon

(IFN) e outras citocinas, na tentativa de prevenir a propagação da infecção

(PASIEKA et al., 2006). Bordignon (2008) comparou dados de genômica funcional

(microarranjo de DNA) do SNC de camundongos infectados com DENV1 com

fenótipos distintos, sendo uma cepa neurovirulenta (FGA/NA-a5c) e outra não-

neurovirulenta (FGA/89), demonstrando uma grande indução de mRNA de genes

estimulados por interferon (ISG), que possuem atividade antiviral conhecida. Foi

160

observado que as principais vias moduladas, em função da infecção do SNC dos

camundongos com DENV1, estavam envolvidas com a via de sinalização por IFN,

processamento e apresentação de antígenos, cascata do complemento e

ubiquitinação. Ambas cepas induziam as vias supracitadas, apresentando apenas

diferenças na intensidade de modulação dos genes. Estes dados foram confirmados

por quantificação, pela técnica de PCR em tempo real, dos genes selecionados

como diferencialmente expressos na infecção com a cepa FGA/NA-a5c

(neuroadaptada) versus a cepa FGA/89 (parental). Baseado nesses achados, no

presente trabalho, avaliamos o perfil de expressão de alguns desses genes

representantes das principais vias moduladas durante a infecção tais como: IFN-!,

IFN-", Irf1, Psmb8, C1r, Usp18 e Ccl5, comparando a modulação dos genes entre

as cepas neurovirulentas, o clone infeccioso pBACDV1 e suas variantes mutantes.

Nos resultados obtidos a partir das análises da expressão gênica nos

cérebros dos camundongos infectados com os vírus recombinantes, foi observada

uma modulação maior nos grupos de animais inoculados com os vírus duplo-

mutantes, E405/NS3-435 (Thr

405

Ile/Leu

435

Ser) e E402/NS3-480

(Phe

402

Leu/Leu

480

Ser), e neuroadaptados (FGA/NA-d1d e FGA/NA-P6), em relação

aos demais vírus para todos os genes analisados (Figura 4.40). Os nossos dados

corroboram os resultados de Bordignon (2008), demonstrando que cepas mais

neurovirulentas possuem uma modulação gênica maior em relação aos vírus menos

patogênicos. Essa reposta imune exacerbada está associada a altas taxas de

mortalidade (Figura 4.37) e replicação viral no SNC dos animais inoculados com

esses vírus (Figura 4.39).

O processamento de antígenos e sua apresentação à linfócitos T é um

processo muito importante na geração da resposta imune adaptativa (GROETTRUP

et al., 1996; VAN DEN EYNDE, MOREL, 2001). Tendo em vista os dados que

indicam a modulação positiva dos genes da via de apresentação de antígenos,

Bordignon et al. (2008) sugerem três hipóteses para explicar esses resultados:

expressão dessas moléculas em neurônios infectados; células “acessórias”, como a

micróglia, oligodendrócitos ou células endoteliais, induzida por citocinas secretadas

por neurônios infectados; ou ainda, por células periféricas que infiltram no SNC em

processo inflamatório.

Interferon do tipo 1 (IFN-!/") tem atraído atenção dos pesquisadores nos

últimos anos devido ao significativo papel que estas citocinas desempenham no

161

estabelecimento da proteção contra patógenos (GARCIA-SASTRE; BIRON, 2006).

Foi demonstrado que DENV induz uma forte resposta IFN-!/" em infecções naturais

(KURANE et al., 1993). Estudos dos níveis de citocinas em amostras de plasma de

pacientes infectados com DENV demonstraram padrões característicos de respostas

dessas citocinas durante o curso da infecção por DENV, sendo que a liberação de

IFN-! ocorre nos primeiros momentos da infecção, parecendo ser crítico para a

resposta imune precoce e resistência à infecção por DENV (SHRESTA et al., 2004;

NAVARRO-SÁNCHEZ, DESPRÈS, CEDILLO-BARRON, 2005). Johnson e Roehrig

(1999) evidenciaram o papel fundamental de IFN-!/" na proteção contra infecções

por dengue em experimentos com animais knockout para IFN-!/" e receptores de

IFN-# (AG129), que resultou em alta letalidade e consistente viremia no soro e

tecidos dos animais. A expressão de IFN-! foi muito baixa para todas as amostras

virais ensaiadas neste trabalho (Figura 4.40), muito provavelmente pelo fato de a

expressão desse tipo de IFN ocorrer nas primeiras horas de infecção e as amostras

analisadas terem sido coletadas com 8dpi. Em contrapartida, os níveis de IFN-!

foram mais elevados.

O processo de ubiquitinação clássica tem como objetivo a degradação de

proteínas intracelulares, através da marcação destas moléculas para

reconhecimento pelo proteassomo. A expressão de ISG15, uma proteína tipo-

ubiquitina, e de proteínas de ISGylation, uma via funcionalmente semelhante à

ubiquitinação clássica, foram identificadas sendo altamente induzidas em infecções

virais (KIM; ZHANG, 2003). A proteína Usp18, ou também conhecida como UBP43,

foi identificada como sendo uma ISG15 protease “desconjugadora” (MALAKHOV et

al. 2002). Foi demonstrado que a Usp18 é capaz de se ligar a um receptor celular

que interage com a quinase do tipo Janus (JAK1), bloqueando toda a via

subsequente de ativação de IFN, reduzindo sua expressão e consequentemente,

diminuindo a resistência a infecções virais. Desta maneira, a Usp18 funciona como

uma reguladora negativa da via de IFN, sendo importante no controle das respostas

mediadas por IFN, auxiliando na manutenção da homeostasia (MALAKHOVA et al.,

2006). Assim como o IFN-!, a expressão do gene Usp18 foi baixa (menos de 9

vezes modulado), em comparação com os outros genes.

Todos os demais genes analisados, Irf1, C1r, Psmb8 e Ccl5, tiveram uma

modulação intermediária (variando entre 10.5 a 16 vezes modulados), para os vírus

162

E405/NS3-435 (Thr

405

Ile/Leu

435

Ser) e E402/NS3-480 (Phe

402

Leu/Leu

480

Ser) em

comparação com os demais vírus e controles.

O sistema complemento, sendo considerado um pilar da imunidade inata, tem

sido reconhecido como um modulador-chave da imunidade adaptativa, atuando

diretamente, regulando e modificando as respostas dos linfócitos estimulados

(NAVARRO-SÁNCHEZ; DESPRÈS; CEDILLO-BARRON, 2005). O sistema

complemento é constituído tanto por proteínas de superfície celular quanto solúveis,

que atuam na lise celular, opsonização de antígenos promovendo a fagocitose,

ligação a receptores desencadeando eventos imunoregulatórios e remoção de

imunocomplexos da circulação (GOLDSBY et al., 2002; CARROLL, 2004). A cascata

do complemento é ativada pelo complexo vírus-anticorpo, além de diversas

citocinas, para liberação dos elementos C3a e C5a que possuem efeito direto na

permeabilidade vascular. O efeito sinérgico de IFN-! e TNF-! acabam ativando as

proteínas do complemento a provocar um vazamento em células endoteliais durante

infecções secundárias (SHAIO et al., 1992; LEI et al., 2001).

As quimiocinas são moléculas de pequeno peso molecular com atividade

quimioatrativa, que podem desempenhar um papel importante na patogenia da

encefalite pelo vírus da dengue. Podem ser divididas em quatro grupos, de acordo

com a posição do aminoácido cisteína na sua porção N-terminal, sendo

quimioatrativas para linfócitos T ativados, monócitos/macrófagos, eosinófilos, células

dendríticas, basófilos, células NK e neutrófilos, dependendo do grupo a que

pertençam (KARPUS, 2001; HUANG et al., 2000). Foi visto que a quimiocina Ccl5

está envolvida no processo de patogênese de doenças neurodegenerativas, sendo

demonstrada melhora significativa da função neurológica em camundongos,

associada à redução da desmielinização e do acúmulo de macrófagos e células T no

SNC, após a administração de anticorpos anti-Ccl5 em modelo murino de esclerose

múltipla induzida pela infecção com o MHV (vírus da hepatite murina) (GLASS et al.,

2004). Além disso, a Ccl5 também desempenha um papel protetor em infecções

virais, tendo sido demonstrado que animais deficientes para o seu receptor (CCR5)

apresentaram maior suscetibilidade à infecção pelo vírus Herpes Simples-2 (HSV-2)

(THAPA; KUZIEL; CARR, 2007).

Recentemente, Sariol et al. (2007), utilizando modelo de macacos Rhesus,

avaliaram as alterações de perfil de expressão de citocinas após infectar esses

animais com DENV1. Foi demonstrado que a infecção de linfócitos B, macrófagos e

163

células polimorfonucleares (PBMC) de macacos com DENV1 induz a manifestação

de uma potente resposta imune após 5 dias de infecção, induzida pela expressão de

genes estimulados por IFN (ISGs) que apresentam atividade antiviral. Além disso,

não foi detectada a superexpressão dos genes de IFN-!, IFN-" ou IFN-#, bem como

de IL-10, IL-8, IL-6, TNF-!. A ausência dessas citocinas pode explicar porque

macacos não apresentam sinais clínicos da infecção pelo vírus da dengue, apesar

de serem susceptíveis à infecção e realizarem soroconversão.

Um outro estudo avaliou o perfil de expressão gênica do sangue total de

pacientes com DSS e com DHF. Foram identificados 24 genes diferencialmente

modulados entre esses pacientes, sendo observada uma menor taxa de transcrição

gênica nos pacientes com DSS. Dentre esses genes, a maioria era induzida por IFN

tipo I, sugerindo que a DSS pode ser desencadeada pela atenuação de alguns

fatores da resposta imune inata (SIMMONS et al., 2007).

As encefalites virais se apresentam com lesões mediadas tanto pela

replicação viral quanto pela resposta imunológica do hospedeiro. A resposta imune

frente a infecções por flavivírus pode provocar sérios prejuízos ao hospedeiro

(KREIL; EIBL 1996; MORI et al., 1997). Porém, o espectro e a intensidade das

respostas imunes no SNC devem ser finamente regulados, a fim de limitar os danos,

uma vez que se trata de um tecido não-regenerativo. Em algumas infecções por

flavivírus, como o vírus da encefalite de St. Louis (SLEV) (MURPHY et al., 1968),

JEV (ESIRI, 1989; LIAO et al.,1997, KUMAR et al., 2009; MISHRA et al., 2009),

WNV (CAMENGA; NATHANSON; COLE, 1974; SHRESTHA, GOTTLIEB,

DIAMOND, 2003; DAI et al., 2008) e DENV (HOTTA, 1952; DESPRÈS et al., 1996,

1998; DUARTE DOS SANTOS et al., 2000; NOGUEIRA et al., 2002; BORDIGNON

et al., 2007), têm sido observados a indução de dano e morte neuronal, associados

à encefalite. A presença de antígenos do vírus da dengue foi identificada em tecido

cerebral, aparentemente em neurônios, astrócitos, micróglia e células endoteliais, de

um caso fatal de DHF, pela técnica de imunohistoquímica utilizando anticorpo

dengue-específico. Também foram detectadas partículas virais do sorotipo 4 de

DENV em amostras da medula e cerebelo do mesmo paciente (RAMOS et al.,

1998). Outros autores descreveram um caso fatal de dengue no Brasil no qual

detectaram células com marcação positiva antígeno-específica contra dengue em

neurônios e isolamento positivo para DENV2 em células do tecido cerebral, fígado e

linfonodos (NOGUEIRA et al., 2002).

164

Os dados histológicos observados nesse estudo sugerem que as principais

células-alvo da infecção no SNC murino são os neurônios, principalmente os

localizados no córtex frontal e temporal, além do hipocampo, regiões relacionadas

ao equilíbrio e controle motor, o que indica a relação entre estas lesões e os

sintomas observados nos animais infectados. Foi evidenciada a presença de

infiltrado mononuclear, morte neuronal, nódulo microglial, além de meningite. Os

danos de maior extensão foram identificados nos animais inoculados com os vírus

E405/NS3-435 (Thr

405

Ile/Leu

435

Ser) e E402/NS3-480 (Phe

402

Leu/Leu

480

Ser),

corroborando com os dados de carga viral. A presença de processo inflamatório e

ativação da micróglia no SNC de camundongos infectados sugere que o processo

de morte celular por necrose seja o mecanismo mais provável para o

desenvolvimento de encefalite fatal nos camundongos.

Os dados obtidos nesse trabalho são muito consistentes, tendo em vista que

mutações associadas com uma determinada cepa viral foram ensaiadas no contexto

de uma outra cepa e seus efeitos foram analisados levando em conta diferentes

aspectos com relação à infecção viral (replicação, resposta imune, dano tecidual),

permitindo assim avaliar sua real importância no desenvolvimento do fenótipo de

neurovirulência em camundongos.

A mutação no domínio NS3hel aumentaria a eficiência de replicação do RNA

viral enquanto a mutação na proteína E poderia estar alterando a conformação da

proteína, levando a uma interação mais eficiente com membranas celulares ou

receptores, e potencializando a infecção.

O conjunto de resultados deste trabalho demonstrou que vírus recombinantes

exibindo mutações pontuais únicas no domínio helicase da proteína NS3,

associadas à mutação na região E H1

pred

de DENV1 são capazes de exibir um

fenótipo de neurovirulência em modelo murino. O desencadeamento do quadro de

encefalite dos animais está diretamente relacionado com uma maior habilidade de

replicação viral no SNC, produção de progênie e indução de resposta imune inata

exacerbada (não-fisiológica) levando ao dano tecidual e morte.

Considerando que o conhecimento sobre as bases moleculares do processo

de neuropatogênese decorrente da infecção por DENV é limitado, este modelo de

estudo poderá contribuir para a determinação de bases de atenuação de cepas

vacinais, processos de interação vírus/hospedeiro e fornecer novas informações

165

sobre os mecanismos da patogênese da dengue, podendo eventualmente nortear

estratégias de controle da infecção.

166

6. CONCLUSÕES

• As mutações implicadas no fenótipo viral de neurovirulência da dengue foram

inseridas no contexto do clone infeccioso pBACDV1, gerando vírus

recombinantes capazes de replicar eficientemente em culturas de células de

inseto, sendo produzidos lotes purificados em gradiente de sacarose e com

altos títulos virais.

• Os vírus recombinantes gerados foram avaliados quanto à sua habilidade de

causar efeito citopático em culturas de células de inseto C6/36 e foi constatado

que a mutação E405 é capaz de inibir o fenótipo de fusão celular nestas

culturas.

• Os animais inoculados com os vírus recombinantes NS3-435, NS3-480,

E405/NS3-435 e E402/NS3-480, desenvolveram sintomas similares aos das

cepas neurovirulentas, como sinais de encefalite e paralisia parcial dos

membros inferiores, enquanto os grupos de animais inoculados com mock, e

com os vírus recombinantes pBACDV1, E402, E405, NS3-209 e E402/NS3-

209, não apresentaram nenhum sinal de doença.

• Alguns dos animais que apresentaram sinais de doença acabaram sucumbindo

à infecção, sugerindo que as mutações NS3-435 e NS3-480 desempenhem um

papel importante no desencadeamento da neuropatogênese em camundongos.

• As mutações E402 e E405 isoladas não são capazes de causar doença ou

morte dos animais. Porém, quando combinadas com as mutações da proteína

NS3, desempenham um papel importante desencadeando doença neurológica

e morte, evidenciando um efeito sinérgico das mutações na doença e morte

dos animais.

• As taxas de replicação viral no tecido cerebral foram mais expressivas nos

animais inoculados com os vírus recombinantes E405/NS3-435 e E402/NS3-

480, que também apresentaram as taxas de mortalidade mais altas.

• As principais células-alvo da infecção no SNC murino são os neurônios,

principalmente os do córtex frontal e temporal, além do hipocampo. Estas

regiões afetadas estão relacionadas ao equilíbrio e controle motor, o que

explica os sintomas observados nos animais infectados.

167

• Todos os animais inoculados com os vírus recombinantes apresentaram danos

no tecido cerebral, sendo evidenciada a presença de infiltrado mononuclear,

necrose neuronal, nódulo microglial, além de meningite, moderada a aguda, e

os danos de maior extensão foram identificados nos animais inoculados com

os vírus recombinantes E405/NS3-435 e E402/NS3-480, resultados esses que

estão diretamente relacionados com os dados de carga viral.

• Os experimentos de expressão gênica demonstraram uma maior modulação da

expressão de genes relacionados a resposta imune inata, nos grupos de

animais inoculados com os vírus duplo-mutantes E402/NS3-480 e E405/NS3-

435, dado que indica que uma resposta imune mais exacerbada poderia estar

associada a altas taxas de mortalidade.

• As assinaturas moleculares nas proteínas NS3hel e E identificadas nas cepas

neurovirulentas estão diretamente envolvidas na aquisição do fenótipo, pois

quando inseridas em um novo contexto, isto é, uma outra cepa viral (DENV1

BR/90), foram capazes de causar os mesmos sintomas neuropatológicos dos

vírus neuroadaptados (FGA/NA-d1d e FGA/NA-P6).

168

7. PERSPECTIVAS

• Obter o clone triplo-mutante (E402/NS3-209/NS3-480) e caracterizar, in vitro e

in vivo, o vírus recombinante resultante.

• Realizar estudos complementares sobre o papel da mutação E405 no processo

de inibição do efeito citopático em culturas de células de inseto.

• Realizar ensaios funcionais (atividade helicase e ATPase) da proteína NS3

recombinante contendo as mutações Leu

435

Ser e Leu

480

Ser.

• Estudar a interação das proteínas NS3 mutadas, Leu

435

Ser e Leu

480

Ser, com

outras proteínas do complexo de replicação ou fatores celulares através de

ensaios de co-imunoprecipitação.

• Realizar caracterizações complementares das mutações Leu

435

Ser e Leu

480

Ser

utilizando sistema subgenômico de replicon.

• Analisar o possível papel do caráter do resíduo de aminoácido na posição 480

da proteína NS3 no fenótipo de neurovirulêcia, através da clonagem e geração

de vírus recombinantes com diferentes aminoácidos nesta posição.

• Realizar a caracterização funcional do papel da via de sinalização de IFN no

curso da infecção com os vírus recombinantes e controles em animais

knockouts para o receptor de IFN tipo I.

169

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APÊNDICE

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Construction of an infectious cDNA clone for a Brazilian prototype strain of

dengue virus type 1: Characterization of a temperature-sensitive

mutation in NS1

Ryosuke Suzuki

a,b

, Luana de Borba

a,c

, Claudia N. Duarte dos Santos

, Peter W. Mason

a,d,

⁎

Department of Pathology, University of Texas Medical Branch, 3.206B Mary Moody Northen Pavilion, 301 University Boulevard,

Galveston, TX 77555-0436, USA

Department of Virology II, National Institute of Infectious Diseases, Shinjuku-ku, Tokyo, 162-8640, Japan

Instituto de Biologia Molecular do Paraná (IBMP), FIOCRUZ, Curitiba, Paraná, 81350-010, Brazil

Sealy Center for Vaccine Development, University of Texas Medical Branch, Galveston, TX 77555, USA

Received 11 October 2006; returned to author for revision 1 November 2006; accepted 16 November 2006

Available online 6 February 2007

Abstract

To help understand the mechanism of pathogenesis of dengue virus (DV), we set out to create an infectious cDNA of the Brazilian prototype

strain of DV serotype 1 (DV1-BR/90). PCR-amplified fragments of DV1-BR/90 cDNA were readily assembled into a subgenomic cDNA that

could be used to produce replicating RNAs (replicons), lacking the structural protein-encoding regions of the genome. However, assembly of a

cDNA capable of producing infectious virus was only possible using a bacterial artificial chromosome plasmid, indicating that DV1 sequences

were especially difficult to propagate in E. coli. While characterizing our cDNA we discovered a fortuitous temperature-sensitive mutation in the

NS1 encoding region. Using our infectious cDNA and a renilla luciferase-expressing replicon we were able to demonstrate that this mutation

produced a defect in RNA replication at 37 °C, demonstrating that the DV1 NS1 protein plays an essential role in RNA replication.

Keywords: Dengue virus; Replicon; NS1; Temperature-sensitive mutant; Replication

Introduction

Dengue viruses (DV) are the etiologic agents of dengue fever

(DF), dengue hemorrhagic fever and dengue shock syndrome.

The viruses are transmitted to humans by Aedes mosquitoes.

DV infections are a serious cause of morbidity and mortali ty in

most tropical and subtropical areas of the world. Dengue cases

are estimated to occur in up to 100 million individuals annually.

DV belongs to the Flavivirus genus in the family Flaviviridae

and there are four serotypes (DV1 to 4) (Burke and Monath,

2001). The four serotypes of DV do not confer cross-protective

immunity, and epidemiological evidence indicates that immu-

nity to one serotype of DV increases the chance of more severe

diseases upon infection with a second serotype by about ten-

fold (Kurane and Ennis, 1997).

Flaviviruses are single-stranded, positive-sense RNA viruses

that have an approximately 11-kb genome consisting of a single

open reading frame encoding three structural proteins (C, preM/

M and E) and seven non-structural proteins (NS1, NS2A,

NS2B, NS3, NS4A, NS4B and NS5), with non-translated

regions at its 5′ and 3′ terminal (5′UTR and 3′UTR). Flavivirus

RNA replication occurs in the cytoplasm via a negative-strand

intermediate, leading to the accumulation of positive-strand

RNAs. Several NS proteins have been implicated in the process.

The NS2B/NS3 serine proteinase is required for processing at

multiple sites in the NS polyprotein. NS3 also possesses RNA

triphosphatase and RNA helicase activities. NS5 contains

methyltransferases and RNA-dependent RNA polymerase

(Lindenbach and Rice, 2001).

NS1 is a highly conserved glycoprotein containing 12

invariant C residues and two potential N-linked glycosylation

Virology 362 (2007) 374 – 383

www.elsevier.com/locate/yviro

⁎

Corresponding author. Department of Pathology, University of Texas

Medical Branch, 3.206B Mary Moody Northen Pavilion, 301 University

Boulevard, Galveston, TX 77555-0436, USA. Fax: +1 409 747 8150.

E-mail address: [email protected] (P.W. Mason).

doi:10.1016/j.virol.2006.11.026

sites. Although the functions of NS1 have not been fully

elucidated, several lines of evidence suggest that NS1 is

involved in viral RNA replication (Lindenbach and Rice, 1997;

Mackenzie et al., 1996; Muylaert et al., 1997; Westaway et al.,

1997).

Infectious clones have been obtained for multiple flavi-

viruses. The first systems, develo ped for yellow fever virus

{YFV (Rice et al., 1989)} and DV4 (Lai et al., 1991), overcame

the genetic instability of flaviviral genomes in standard E. coli

plasmids by propagating the 5′ and 3′ halves of the genomes

into separate fragments, followed by in vitro ligation of the

fragments to produce a template for production of synthetic

genome-length RNAs. Subsequent strategies that have been

used to propagate genom e-length cDNAs that could be used

directly as templates for the production of infectious RNAs have

included the use of yeast plasmids (Polo et al., 1997), low-copy

plasmids (Gualano et al., 1998) or bacterial artificial chromo-

somes (BAC) plasmids (Van der Most et al., 1999) to overcome

these E. coli instability problems.

Based on our successful strategy of using low-copy plasmids

to propagate cDNAs for flavivirus replicons that were readily

converted into genome-length clones for West Nile virus

(WNV) (Rossi et al., 2005) and Japanese encephalitis virus

(JEV) (Ishikawa, Ko nish i and Maso n, unpu blished ), we

designed a similar strategy to produce an infectious cDNA for

DV1. Although our low-copy plasmid was suitable for DV1

replicon construction, we were unable to use this plasmid to

produce an infectious genome-length DV1 cDNA. However, an

infectious cDNA was readily obtained in a BAC plasmid.

Furthermore, while characterizing this cDNA we discovered a

fortuitous mutation in NS1 that produced a temperature-

sensitive (ts) form of the protein that permitted us to

demonstrate the importance of NS1 in DV genome replication.

Results

Construction of cDNA encoding a replicon and an infectious

DV1 RNA

Standard methods were used to create a subgenomic replicon

from DV1-BR/90, the prototype strain of DV1 isolated in 1990

from a DF patient in Rio de Janeiro, Brazil. The viral RNA was

extracted from infected C6/36 cells, reverse transcribed into

cDNA and amplified in individual dsDNA fragments as shown

in Fig. 1. The five individual fragments required to produce a

replicon-length cDNA were readily assembled into the low-

copy plasmid pACDV1poly. Synthetic RNAs produced from

this plasmid (designated pACDV1repNS1*NS3*; see below)

replicated well when introduced into BHK cells (see Fig. S1).

Comparison of the sequence of this replicon and the PCR

amplicons used to generate it revealed two changes in encoded

amino acids, one in NS1 and a second in NS3 (see Table 1,

discussed in detail below). Nevertheless, cells transfected with

this replicon produced high levels of antigen when detected

with either a polyclonal sera (results not shown) or a MAb to

NS1 (Fig. S1).

Fig. 1. (A) Schematic representation of the DV1-BR/90 genome showing the position of the restriction enzymes sites (NotI, BspTI, NgoMIV, PshAI, PmlI, SapI, XhoI

and MluI) and fragments used to assemble the replicon cDNA encoded by pACDV1repNS1*NS3*. Position of the T7 promoter is shown on the left, and positions of

the SapI and the HDV-RZ/bacteriophage T7 terminator fragments (which included a downstream SwaI site for linearization and an XhoI site for insertion) are shown at

the right. (B) Schematic representation of the structural protein-encoding cDNA fragment present in pACDV1T7-C-NS1 and the cDNA present in BAC plasmid

pBACDV1flcNS1*NS3*. (C) Structure and position of Rluc encoding cistron added to the 3′ UTR of DV1repNS1*. The “*” above NS1 and NS3 are used to indicate

the position of coding differences with the BR/90 amplicon (see Table 1 and text for details).

375R. Suzuki et al. / Virology 362 (2007) 374–383

To construct a genome-length, infectious cDNA from

pACDV1repNS1*NS3*, we created a low-copy plasmid

encoding the 5′UTR and C-NS1 polyprotein of DV1-BR/90

(designated pACDV1T7-C-NS1; Fig. 1). Sequence analyses of

pACDV1T7-C-NS1 confirmed that its sequence was identical

to that in the DV1-BR/90 amplicons used to create it. Using

multiple different restriction endonuclease assembly strategies,

genome-length cDNAs were very difficult to assemble from

pACDV1repNS1*NS3 * and pACDV1T7-C -NS1. Furthermore,

even when obtained, bacterial colonies harboring plasmids that

had restriction maps consistent with full-length cDNAs grew

very poorly. Moreover, when RNAs produced from the cDNA

templates prepared from these bacter ia were transfected into

BHK cells, they failed to produce cells expressing any

detectable DV1 antigen (results not shown). Since we

successfully applied these same assembly methods to recover

infectious cDNAs for WNV (Rossi et al., 2005) and JEV

(Ishikawa, Konishi, and Mason, unpublished), these results

suggested an especially severe genetic incompatibility/instabil-

ity of full-length DV1 cDNAs in E. coli (see Introduction).

To overcome the apparent genetic instability/incompatibil-

ity of the DV1 cDNA sequences with our low-copy plasmid,

we transferred the subgenomic replicon cDNA to a BAC

plasmid and then added back the 5′ end of the genome en-

coding the structural proteins from pACDV1T7-C-NS1 (see

Fig. 1). Initial analyses demonstrated that synthetic RNAs from

all three full-length BAC plasmid clones isolated from the first

assembly attempt produced large numbers of antigen-positive

cells (Fig. S2). One of these BAC p lasmids , designated

pBACDV1flcNS1*NS3*, was sequenced in its entirety (see

Table 1) and used for all further studies.

Characterization of DV1flcNS1*NS3*

BHK cells transfected with synthetic RNA produced from

pBACDV1flcNS1*NS3* produced large numbers of antigen-

positive cells when stained with antibodies specific for either E

or NS1 (up to 50% of the cells in these cultures were antigen-

positive 2 days after electroporation). However, the number of

immunopositive cells in these cultures did not increase upon

further cultivat ion, and infectious titer of DV in the supernatant

fluid recovered from cells at all days up to and including day

8 post-electroporation was undetectable (Fig. S2 and results not

shown). When C7/10 cells were electroporated with this RNA

transcribed from this cDNA, a small number of immunopositive

cells were detected on day 2, indicating that our electroporation

methods were less efficient with mosquito cells than with BHK

cells. However, by day 4, most of the cells in these transfected

cultures were immunopositive, and by day 6, all cells stained

strongly with DV-specific antibodies (Fig. 2). These results

suggest that DV1 infection spread in these C7/10 cells,

furthermore, titration of the supernatant fluid recovered from

these electroporated cells revealed viral replication (approxi-

mately 4 × 10

focus-forming units (ffu)/ml on day 5 when

titrated on C7/10 cells), indicating that pBACDV1flcNS1*NS3*

was an infectious cDNA. However, the foci size of this virus,

designated DV1flcNS1*NS3*, appeared smaller than parental

DV1-BR/90 on C7/10, C6/36 and especially Vero cells (Fig. S3.

Table 1

Summary of nucleotide and amino acid sequence

differences between the GenBank-deposited sequences of BR/90, the BR/90 amplicons used to generate our

infectious cDNAs and various cloned cDNAs

Base position

(codon)

Coding

region

BR/90

GenBank

BR/90

amplicons

pACDV1rep

NS1*NS3*

pACDV1

T7-C-NS1

pBACDV1flc

NS1*NS3*

pBACDV1flc

325 C A G G G G

1213 E A U U U U

1258 E U C C C C

1291 E U C C C C

1378 E A G G G G

1639 E C U U U U

1648 E U C C C C

2719 NS1 G A A A A

3159 (247) NS1 A (Y)

A (Y)

G (C) G (C) A (Y)

3265 NS1 C U U U U

3346 NS1 U U C C U

3424 NS1 C U U U U

3907 (144) NS2A C (H) G (Q)

G (Q)

4627 NS3 G A A A A

5250 (211) NS3 A (Q)

A (Q)

G (R) G (R) A (Q)

5413 NS3 A A A A G

6148 NS3 U U C C C

6598 NS4A A A G G G

10,195 NS5 G G A A A

10,258 NS5 A A G G G

Encoded amino acid sequences, when different, are shown in “()”.

Position of nucleotide change (within genome) and codon change (within the individual protein-encoding region).

AF226685.

Amino acid encoded at this position in all GenBank-deposited DV1 sequences examined (AY145121, AB178040, NC_001477, AY732483, AY726555,

DQ193572, AB204803, AF311956, AF311957, AF311958, and AF513110) except for AF226685 (see text).

376 R. Suzuki et al. / Virology 362 (2007) 374–383

Generation of repaired DV1 cDNA clones

To begin to dissect the reason of phenotypic difference bet-

ween DV1flcNS1*NS3* and DV1-BR/90, a detailed comparison

was made between the entire cDNA in pBACDV1flcNS1*NS3*,

the RNA stock used to create it and various DV1 sequences

(summarized in Table 1). These analyses confirmed that the

assembly of the genomic fragments from the low-copy plas-

mids pACDV1repNS1*NS3* and pACDV1T7-C-NS1 into

pBACDV1flcNS1*NS3* did not result in the selection of any

nucleic acid differences, confirming the utility of the BAC

plasmid in propagating the DV1 cDNAs. These analyses also

confirmed that there were only 3 coding differences between the

GenBank-deposited sequence of BR/90 (AF226685) and

pBACDV1flcNS1*NS3*. Although a number of sequence diffe-

rences appeared to be restricted to particular cloned fragments, it

is unclear if the differences obtained in the E. coli-propagated

cDNA fragments represented quasispecies in the viral RNA or a

combination of PCR-introduced errors and E. coli selection

(Table 1 and results not shown).

In the case of the three coding mutations, the NS2A position

#144 difference between the GenBank-deposited sequenc e for

DV1-BR/90 and our PCR amplicon was discounted from consi-

deration since the Q encoded by our parental virus PCR

amplicon and all of our cloned cDNAs (Fig. 1, Table 1 and results

not shown) was shared by multiple other GenBank sequences for

DV1 (see Table 1). The NS1 Y at position 247 and the NS3 Q at

aa position 211 were present in our BR/90 amplicon, and all

GenBank-deposited DV1 sequences examined (see above, and

Table 1), but were altered in pBACDV1flcNS1*NS3*, and the

low-copy plasmid-propagated cDNAs used to create it (Table 1).

Furthermore, sequencing of several other low-copy plasmid

clones of DV1-BR/90 cDNA spanning these regions demon-

strated that it was possible to clone cDNA plasmids with the

consensus sequence contained in the parent al viral cDNA

amplicon (results not shown), thus these two differences were

considered mutations associated with PCR amplification and/or

cloning in low-copy plasmids.

To examine the role of the NS1 and NS3 mutations on the

DV1flcNS1*NS3* phenotype, several additional infectious

cDNAs were engineered with wild-type (WT) codons at one or

both of these positions (Fig. 3). The infectivity of these full-length

DV1 transcripts was tested in BHK and C7/10 cells. Cells were

transfected with RNA transcripts by using Lipofectin and cultured

for 4 days under a semi-solid overlay followed by immunostaining

for DV1 antigen as shown in Fig. 3B. When RNAs were

transfected into C7/10 cells, foci formation was observed in all

clones, however, foci produced by RNAs obtained from

pBACDV1flcNS1*NS3* and pBACDV1fl NS 3* were small er

than the foci produced from the cDNA plasmids encoding the WT

NS3 Q, indicating that the R mutation in NS3 resulted in small foci

size in C7/10 cells. In the case of transfected BHK cells, RNAs

derived from clones with the WT NS1 sequences

(pBACDV1flcNS3* and pBACDV1flc) produced foci (Fig. 3B),

whereas RNAs from pBACDV1flcNS1*NS3* did not produce

foci, and very small foci were observed with RNAs produced from

pBACDV1flcNS1* (Fig. 3B). These results suggest that, although

mutations in either NS1 or NS3 affected viral production in BHK

cells, the NS1 mutation was the primary cause of defect of DV1

growth in these cells. As expected, side-by-side plaque assays of

DV1flc and the parental virus on C7/10 cells and Vero cells

showed indistinguishableplaquemorphologies(Fig. 3C).

Phenotypic characterization of NS1 mutant

To further investigate the effect of the NS1 mutation on viral

production from our infectious cDNAs, we compared the

production of virus from cells infected with WT and NS1 mutant

viruses at 30 °C or 37 °C. To this end, BHK cells were

electroporated with transcribed RNA from pBACDV1flcNS1* or

pBACDV1flc, diluted with naive BHK cells, and following

attachment, the cell monolayers were cultured for 5 days under a

semi-solid overlay and then immunostained to reveal DV1 foci. As

shown in Fig. 4,focimorphologywassimilarfortheprogeny

viruses derived from both pBACDV1flcNS1* or pBACDV1flc

RNAs in BHK cells at 30 °C. However , in contrast, foci produced

by RNA from pBACDV1flcNS1* were smaller than those

produced by RNA from pBACDV1flc when these viruses were

propagated in the cells at 37 °C (Fig. 4). To further explore the

effect of temperature on the replication of DV1flcNS1*, side-by-

side growth curves were generated with this virus and DV1flc in

infected Vero cells grown at 30 °C and 37 °C (Fig. 5). These

studies showed that at 30 °C, DV1flcNS1* replicated at similar

levels to DV1flc. However , at 37 °C, DV1flcNS1* growth was

delayed relative to DV1flc. T aken together, these results indicate

that a C at codon 247 in NS1 produces a ts defect in NS1.

Effect of NS1 mutation on virus entry

Since NS1 is retained in the same cellular compartment as

immature flavivirus provirions (Lindenbach and Rice, 2001),

we reasoned that mutation 247 in NS1 could alter virus

maturation and/or NS1 could be associated with the virion,

Fig. 2. Micrograph of monolayers of C7/10 cells electroporated with the in vitro

transcript of pBACDV1flcNS1*NS3* and then fixed at the indicated time post-

electroporation and stained with MAb D2-7E11.

377R. Suzuki et al. / Virology 362 (2007) 374–383

altering virion infectivity. To determine if the NS1 247 ts

mutation altered virion maturation and/or its infectivity at the

non-permissive temperature, we performed a temperature shift

experiment. In this assay, WT and mutant virus were incubated

with Vero cells at 30 °C or 37 °C for 5 h (long enough to bind,

penetrate and uncoat the genome of DV) and then incubated for

5 days at either of these temperatures. The results of this

experiment, shown in Fig. 6, demonstrate that the NS1 mutation

does not affect virus binding or establishment of replication

since the WT and mutant viruses produce similar numbers of

foci and similar-sized foci if the infection is conduct ed at 30 °C

or 37 °C and then followed by a 5-day incubation at 30 °C.

However, the number and size of foci produced by DV1flcNS1*

were both drastically reduced when the post-entry phase of the

experiment was performed at 37 °C (Fig. 6). These results

suggest that this NS1 mutation has little (or no) effect on virus

entry and uncoating and is likely to effect RNA genome

replication and/or packaging and virion relea se.

Effect of NS1 ts mutation on RNA replication

To evaluate the role of the NS1 mutation in RNA replication,

we developed a replicon of DV1 containing the renilla

Fig. 3. Demonstration of the effect of NS1 and NS3 mutations on recombinant

virus focus formation on monolayers of C7/10 and BHK cells. (A) Schematic

representation of the genome of DV1 showing all of the amino acid coding

differences between DV1-BR/90 and our BAC plasmid encoded genomes. The

position of amino acid residues of NS1 and NS3 that differed between these

genomes is shown at the top; bold type has been used to designate the amino

acids of consensus sequence in DV1 (see text and Table 1). (B) Photographs of

monolayers C7/10 and BHK cells transfected with Lipofectin using similar

amounts of synthetic RNA (20 ng) from the indicated BAC clones, overlaid with

semi-solid media and stained with anti-NS1 antibody 4 days after transfection.

DV1flc, overlaid with semi-solid media and fixed and immunostained with anti-

NS1 antibody 4 days (C/710) or 5 days (Vero) after incubation at 30 °C (C7/10)

or 37 °C (Vero).

Fig. 4. Photographs of monolayers of cells transfected with synthetic RNA from

pBACDV1flcNS1* and pBACDV1flc and then grown at 30 °C or 37 °C. BHK

cells were electroporated with transcribed RNA from pBACDV1flcNS1* and

pBACDV1flc, diluted with naive BHK cells, incubated for 5 days at indicated

temperature then fixed and stained with MAb D2-7E11. In all cases, the same

dilution (10-fold) of electroporated cells is shown.

Fig. 5. Growth curves of DV1flcNS1* and DV1flc on Vero cells at 30 °C or

37 °C. Monolayers of Vero cells were infected with the indicated virus at a

multiplicity of infection (MOI) of 0.01 and incubated at the indicated

temperature. At each time point, the media were removed and frozen for

subsequent titration and fresh media were added. Virus titers in cell culture

medium were determined by plaque assay in Vero cells incubated at 30 °C.

378 R. Suzuki et al. / Virology 362 (2007) 374–383

luciferase (Rluc) reporter gene with or without the position 247

NS1 mutation (see Materials and methods and Fig. 1). These

replicon RNAs were electroporated into BHK cells, and

luciferase activities were measured at 6 h and 4 days post-

electroporation. The values obtained 6 h after electroporation

were nearly identical for both replicons at both temperatures,

indicating that as expected the differences in NS1 position 247

had no effect on the initial translational activity of the reporter

gene encoded by the transfected replicon RNA. For the later time

point, these 6-h activities were used to normalize for transfection

efficiency (see legend for Fig. 7). These Rluc data show that the

replicon harboring the NS1 mutation (DV1repNS1*) replicated

much more poorly than the WT replicon at 37 °C (Fig. 7). In

contrast, Rluc activities detected in lysates obtained from the

same electroporations and then incubated at 30 °C contained

indistinguishable levels of Rluc activity. These data indicate that

the ts NS1 mutation reduces viral replication by reducing RNA

replication.

Effect of NS1 mutation on polyprotein processing and NS1

secretion

To examine whether the ts mutation in NS1 affected

processing and secretion of NS1 in infected cells, cells were

infected with DV1flcNS1* or DV1flc for 5 days at 30 °C and

then incubated for an additional 2 days at 37 °C. As shown in

Fig. 8A, Western blot analyses revealed no obvious difference

in the electrophoretic migration of NS1* versus NS1 or the

amount of NS1 and NS1* present in cells at this time point.

Furthermore, Western blot analyses of the NS1 present in

the culture fluid harvested from these cells failed to reveal any

gross defect in the dimerization or release of NS1* or NS1 from

these cultures (Fig. 8B). Specifically, a heat-labile NS1 form

matching the predicted dimer MW of 90 k was present in culture

fluid harvested from cells infected with either DV1flcNS1* or

DV1flc. Despite the lack of detectable differences in the quality

of NS1 produced by DV1flcNS1* or DV1flc in cells grown at

the non-permissive temperature for DV1flcNS1*, we did note a

slight reduction in NS1* production from cells infected with the

mutant virus, likely the result of the reduction in RNA repli-

cation detected with this virus when grown at this temperature

(see above, and Fig. 7). Since the ts mutation consisted of the

Fig. 7. Effect of NS1 mutation on DV1 RNA replication. BHK cells were

electroporated with identical amount of Rluc-expressing DV1 subgenomic

replicon RNAs (with or without the NS1 position 247 mutation), seeded in

multi-well plates, and incubated at 30 °C or 37 °C prior to harvesting lysates for

the determination of Rluc activity (see Materials and methods). Rluc activities

were measured at 6 h and 4 days post-electroporation. The Rluc activity obtained

at 4 days is shown normalized to the activity obtained at 6 h to account for slight

differences in transfection efficiency (see text). Data from each condition are

shown as an average of triplicate values with error bars showing standard

deviations.

Fig. 8. Affect of NS1 mutation on NS1 synthesis and secretion. Western blots

prepared from samples of cell lysates and supernatant fluids obtained from Vero

cells infected at an MOI of 0.01 ffu with either DV1flcNS1* and DV1flc viruses

(or mock-infected), incubated for 5 days at 30 °C (to allow both viruses to infect

the entire monolayer) and then shifted to 37 °C for 2 days. The media were

changed three times with serum free medium 1 day before harvest to insure that

the NS1 protein analyzed represented protein produced at the final incubation

temperature. (A) Replica of Western blot showing the NS1 protein (detected

with MAb D2-7E11) present in cell lysates. (B) Replica of Western showing the

NS1 protein released from the indicated cell monolayers at 37 °C, following

electrophoresis after denaturation in the presence or absence (to preserve dimers)

of heating, and detection with MAb D2-7E11.

Fig. 6. Effect of temperature shift on infectious foci formation by cells infected

with same numbers of ffu of DV1flcNS1* and DV1flc. The left side of the figure

shows the incubation temperatures utilized for the 5-h attachment/infection and

5-day growth/spread portion (performed under semi-solid overlay) of the

experiment, and the right side of the figure shows the resulting monolayers,

fixed and stained with MAb D2-7E11 to reveal infectious foci (see Materials and

methods).

379R. Suzuki et al. / Virology 362 (2007) 374–383

addition of a C residue to NS1* that could have altered disulfide

bond formation in NS1*, we compared the electrophoretic

migration of non-reduced forms of NS1 and NS1* in lysates of

cells prepared at th e non-permis sive tem perature . These

analyses failed to reveal any altered migration (specifically

aggregation, associated with improper disulfide formation;

(Lorenz et al., 2002); results not shown) suggesting that the ts

mutation was not exerting its influence on RNA replication

through a gross alteration in NS1 structure or intracellular

localization.

Discussion

Infectious cDNAs have been reported for a large number of

flaviviruses, including most of the important human pathogens.

In some cases, the apparent incompatibility of full-length viral

cDNAs with commonly used E. coli recombinant DNA

propagation syst ems has hampered development of these

important reagents. Here we have demonstrated the utility of

a BAC plasmid system for propagation of a highly infectious

cDNA from a South American strain of DV1. Specifically, the

cDNAs propagated in BAC plasmids could be used as template

for RNA transcription that generated highly infectious RNAs

with a specific infectivity of more than 10

ffu/μg of RNA.

BAC plasmids have been used by others to produce infectious

cDNA clones for YFV (Van der Most et al., 1999), JEV (Yun et

al., 2003) and DV2 (Pierro et al., 2006), but these investigators

did not directly compare BAC plasmid s to low-copy plasmids,

which have been recently employed by several investigators to

produce full-length clones of flaviviruses (see Introduction). In

our hands, precisely the same low-copy plasmid methods that

were used to successfully establish replicons and infectious

cDNAs for WNV (Rossi et al., 2005) and JEV (Ishikawa,

Konishi and Mason, unpublished) were successfully used to

produce infectious DV1 replicons, but these methods were not

able to be used to produce infectious full-length DV1 genomes.

It is not clear the reason for the differences between these

flaviviruses, but one possibility is that DV1 cDNAs or

spontaneously produced translation products are more toxic to

E. coli cells than the product s produced from other flavivirus

cDNAs.

The strain selected for our studies, DV1-BR/90, is a well-

characterized South Am erican prototype strain derived from an

isolate obtained early after the introduction of DV1 to Brazil.

We selected this strain due to the availability of animal-adapted

derivatives (Duarte dos Santos et al., 2000) and the fact that

DV1-BR/90 provides a useful starting point for comparisons to

strains of DV1 that have evolved in Brazil since the introduction

of DV1 to South America (Duarte dos Santos et al., 2002).

Thus, this cDNA will be useful for understanding the

involvement of animal-adapted and naturally evolved mutations

in DV1 replication, transmission and pathogenesis.

The DV NS1 protein contains two N-l inked glycosylation

sites and 12 conserved C residues that have been shown to form

6 disulfides (Wallis et al., 2004). NS1 is se creted from

mammalian, but not mosquito cells (Mason, 1989) and exists

as a heat-labi le homodimer (Winkler et al., 1988). Alteration of

selected C residues, or the N residues that are glycosylated

during NS1 processing, results in the loss of dimerization and

secretion of the NS1 protein, suggesting that dimerization is

necessary for NS1 secretion (Pryor and Wright, 1993 ).

However, cells infected with a Kunjin virus with a defect in

NS1 dimer formation were able to secrete NS1, and the virus

could replicate, suggesting that dimerization of NS1 is not an

absolute requirement for NS1 secretion as well as NS1 function

(Hall et al., 1999). Although a specific function of extra cellular

forms NS1 has not yet been demonstrated, NS1 has been shown

to be important for replication of YFV. Specifically, mutations

at the first or both N-linked glycosylation sites of YFV NS1 led

to dramatic defects in RNA replication and virus production

(Muylaert et al., 1996). Furthermore, a single amino acid

substitution at position 299 in the YFV NS1 protein resulted in a

defective for RNA accumulation and delayed viral production

in a ts manner (Muylaert et al., 1997). Finally, trans-

complementation studies revealed that NS1 has an important

function at a very early stage in RNA replication (Lindenbach

and Rice, 1997).

Our ts NS1 mutant virus, DV1flcNS1*, encodes an

additional C residue between the naturally occurring C residues

number 6 and 7. At the permissive temperature (30 °C), this

virus is indistinguishable from the WT virus (DV1flc) in terms

of grow th and infecti ous focus for mati on. In additi on,

DV1flcNS1* appears to infect and uncoat with equal efficiency

as the WT virus. However, DV1flcNS1* is retarded with respec t

to virion production at 37 °C. By using a subgenomic replicon

encoding an Rluc reporter gene, we were able to demonstrate

that the ts defect due to the additional C residue was manifest at

the level of reduced RNA replication.

Examination of the processing of NS1* at the non-

permissive temperature showed no obvious differences relative

to WT NS1. Since the alteration in NS1* resulted in the

substitution of a n extra C residue for a Y residue, we

specifically tested to see if this alteration was associated with

changes in dimerization, secretion or misfolding, which could

accompany the addition of an unnatural C, resulting in impaired

disulfide bond formation. However, we were unable to detect

any difference in synthesis, secretion or dimerization of NS1*

when the ts mutant virus was grown at the non-permissive

temperature (37 °C). These results suggest that the Y residue at

position 247 in NS1, which is highly conserved in all DV1

examined (Table 1), might be important for function of NS1.

Interestingly, a P to L substitution at residue 250 in Kunjin virus

NS1 also produced a mutant virus with delayed replication (Hall

et al., 1999), and an R to A mutation at residue 299 in YFV NS1

was also responsible for a ts RNA synthesis phenot ype

(Muylaert et al., 1997), indicating that this C-terminal region

of NS1 plays a critical role in RNA replication for multiple

flaviviruses.

The NS1* mutation resulted in a significant delay in virus

production at the non-permissive temperature during firs t 5 days

of DV1flcNS1* infection in Vero cells, consistent with a role for

NS1 in the early phases of viral RNA replication. However,

DV1flcNS1* titers were indistinguishable from DV1flc titers at

9 days post-infection, suggesting that later stages of virus

380 R. Suzuki et al. / Virology 362 (2007) 374–383

replication were less affected by this mutation. Interestingly, the

ts mutation in NS1* appeared to be relatively stable since we

were unable to detect revertants following attempts to grow the

virus at 37 °C.

The mutation that we detect ed in DV1flcNS1* reduces virus

yield at 37 °C, suggesting that it could attenuate viremia in vivo,

a property that is correlated with disease severity in man

(Murgue et al., 2000; Vaughn et al., 2000). Thus, our NS1*

mutation (or alternative mutations in the C-terminal region of

NS1) might be a useful additions to live-attenuated vaccine

candidates for dengue.

In summary, our work on an infectious cDNA system for

DV1 has demonstrated the advantage of the BAC plasmid over

a widely utilized low-copy plasmid and has identified a novel ts

mutation in NS1 that has been used to demonstrate a role for

NS1 in DV RNA synthesis.

Materials and methods

Plasmids, viruses and cell lines

A low-copy plasmid, design ated pACDV1poly, was derived

from pACNR (Ruggli et al., 1996) by adding a custom

polylinker containing NotI, BspTI, BspEI, NgoMIV, PshAI,

PmlI and XhoI res triction end onuclease sites to facilitate

cloning of DV1 cDNA fragments. A BAC plasmid designated

pBACDV1poly was derived from pBeloBAC11 (a BAC

plasmid containing the Ori2 origin of replication and F (fertility)

factor of E. coli (Shizuya et al., 1992); obtained from I. Frolov)

by removal of a no n-essential NotI fragment and substitution of

a directional polylinker containing a NotI, BamHI, XhoI and

SwaI restriction endonuclease sites to facilitate directional

insertion of DV1 cDNAs fragments cloned into low-copy

plasmids.

DV1-BR/90, a Brazilian DV1 strain isolated from an adult

male with DF in Rio de Janeiro, RJ, Brazil, in 1990 has been

previously described (Despres et al., 1993; Nogueira et al.,

1993). This isolate was obtained from P. Despres (Interactions

Moleculaires Flavi virus-Hôtes, Institut Pasteur, 25 rue du Dr.

Roux, 75724, Paris, cedex 15, France) and then was passaged

an additional 4 times in C6/36 cells, prior to use. Virus stocks

were maintained at − 80 °C.

BHK cells were maintained at 37 °C in minimal e ssential

medium (MEM—Invitrogen) supplemented with 10% fetal

bovine serum (FBS—Gemini) and antibiotics. Vero cells were

maintained at 37 °C in MEM containing 6% FBS and

antibiotics. C7/10 and C6/36 mosquito cell lines were

maintained at 30 °C in Leibovitz's L15 medium (Invitrogen)

supplemented with 10% FBS, 10% tryptose phosphate broth

(Sigma) and antibiotics.

cDNA synthesis, amplification and cloning

Total cellular RNA was extracted from BR/90-infected C6/

36 cells using RNAqueous (Ambion). DV1 RNA present in this

preparation was reverse-transcribed using random hex oligo-

nucleotide primers and Improm-II reverse transcriptase (Pro-

mega). Fragments of DV1-BR/90 cDNA were amplified by the

polymerase chain reaction (PCR) using specific oligonucleotide

primers (see Fig. 1) and a high-fidelity Taq polymerase (Sigma).

The resul ting double -stranded cDNA fragments were resolved

by gel electrophoresis, p urified by stand ard methods (Qiagen),

digested with restriction endonucleases and cloned into

pACDV1poly (see Fig. 1). The oligonucleotide used to amplify

the 5′UTR included a T7 promoter recognition site and an

additional G preceding the first base of the viral genome. In

addition, a synthetic anti sense oligonucleotide was used to add a

BspTI site at codons 30–31 of the C-coding region (following

the cyclization sequence), and a sense oligonucleotide was

designed that added the same site preceding the final

transmembrane domain of the E protein coding sequence to

permit the ligation of C to NS1, permitting the construction of a

subgenomic replicon (Fig. 1). Finally, two alternative strategies

were designed to create synthetic run-off transcripts that

contained a 3′ terminus identical to the viral RNA. The first

consisted the introduct ion of a type IIS restriction endonuclease

site (SapI) downstream of the 3′ end of the cDNA by using an

antisense oligo containing an XhoI site and the SapI site fused

to the comp le me n t of t he 3′ end of the DV1 genome

(CCGCTCGAGGCTCTTCGAGAACCTGTTGATTCAA-

CAGC). The second strategy consisted of using oligonucleo-

tides to fuse a hepatitis delta virus ribozyme (HDV-RZ)/

bacteriophage T7 terminator fragment (Mason et al., 2002) to

the 3′ end of the cDNA using an overlap PCR construction

strategy (Higuchi et al., 1988). PCR-generated cDNA fragments

were individually inserted into pACDV1poly (in some cases by

a multiple step-wise addition process recreating the natural

junctions) and the resulting molecularly cloned plasmids were

isolated by standard techniques and sequences were checked by

automatic nucleotide sequencing and compared to the sequence

of PCR amplicons obtained from mosquito cells infected with

DV1-BR/90 and the original DV1-BR/90 sequence deposited

with GenBank (AF226685). Fragments were assembled into

genome-length cDNAs in the pACDV1poly and pBACDV1-

poly by standard methods (see Fig. 1).

To construct subgenomic DV1 replicons expressing a

humanized Rluc reporter, overlap PCR (Higuchi et al., 1988)

was used to fuse an EMCV IRES to a humanized Rluc gene

derived from pGL4.73 (Promega), and this cassette was inserted

into the variable region of the 3′-UTR (in place of bases − 447 to

− 279 from the last base in the DV1 genome in pBACDV1rep

and related plasmids (see Fig. 1)).

RNA synthesis using in vitro transcription reactions

Plasmids were purified by centrifugation in CsCl gradients

using standard methods. Plasmids were prepared for run-off

transcription by digestion with SapI restriction endonucleases

or SwaI (in the case of HDV-RZ-encoding plasmids), and the

resulting template DNAs were in vitro transcribed using

MegaScript T7 synthesis kit (Ambion) supplemented with a

7mG(ppp)G c ap analo gue (NEB) . This 7mG( ppG) cap

analogue was added to permit efficient cappin g of this synthetic

transcript, which was designed to encode an unnatural G in front

381R. Suzuki et al. / Virology 362 (2007) 374–383

of the normal DV A residue in order to facilitate high level

synthesis with phage T7 polymerase (which produces much

higher levels of RNA from transcripts beginning with a G). The

yield and integrity of transcripts wer e ana lyzed by gel

electrophoresis under nondenaturing condition, and aliquots

of transcription reactions were used for transfection without

additional purification.

RNA transfection

RNA was transfected into BHK or C7/10 monolay ers using

Lipofectin (Invitrogen) by a slight modification of the

manufacturer's suggested protocol. Three hours after transfec-

tion, the RNA/Lipofectin/media was removed from the cell

layer and the cells were re-fed with growth media and incubated

at 30 or 37 °C, as required. BHK or C7/10 cells were

electroporated with T7 transcription reactions as previously

described (Rossi et al., 2005).

Detection of DV-antigen in transfected cells by

immunohistochemical staining

DV1 antigen expressing cells were labeled by a modification

of previously described methods (Rossi et al., 2005). Briefly,

cell monolayers were rinsed with PBS, fixed in co ld acetone/

methanol (1:1), air-dried, rehydrated with PBS containing 1%

normal horse serum (NHS; Sigma) and incubated with DV-

specific antibodies (polyclonal hyperimmune murine ascitic

fluid (HIMAF) from DV1-infected mice (supplied by R.B.

Tesh), an E-specific monoclonal antibody (MAb) D1-4G2

(Gentry et al., 1982) (supplied by R.B. Tesh) or the NS1-

specific MAb D2-7E11 (Mason et al., 1990) (provided by J.R.

Putnak, WRAIIR, Washington DC)) followed by a peroxidase-

conjugated anti-mouse secondary anti body (KPL), an d perox-

idase-labeled cells were stained with the VIP substrate (Vector

Laboratories).

Western blot analysis

Proteins present in cell culture fluid or obtained from triton-

lysed monolayers (lysed in 0.1% triton X-100, 300 mM NaCl,

50 mM Tris, pH 7.6) of infected cells were resolved by SDS-

PAGE (NuPAG E; Invitrogen) and then electrophoretically

transferred to polyvinylidene difluoride membranes (Immobi-

lon). After blocking, these membranes were probed with MAb

D2-7E11 (anti-NS1) and then washed and incubated with a

peroxidase-conjugated anti-mouse antibody (KPL). The deco-

rated NS1 proteins were then detected with the ECL Plus

Western Blotting Detection System (GE Healthcare) and the

image was captur ed on X-ray film.

Viral titrations and growth curves

Cell monolayers prepared in multi-well plates were incubat-

ed with dilutions of virus and then overlaid with growth media

(in some cases co ntaining 0.8% carboxymethyl cellulose

(CMC; Sigma, medium viscosity)) and incubated for the

indicated times and then fixed and immunostained as described

above, and foci were counted a nd used to calculate a titer of ffu/

ml. For grow th curves, Vero cells were infected and then

incubated at the indicated temperature and at selected intervals

the media was removed for storage at − 80 °C (for subsequent

titration) and replaced with fresh media.

Renilla luciferase assay

Monolayers of BHK cells electroporated with Rluc-expres-

sing plasmids were lysed by addition of Reporter Lysis Buffer

(Promega), and the lysates were stored at − 20 °C for

subsequent assay. Prior to assay, the extracts were thawed

and clarified to remove insoluble debris, and a portion of each

extract was mixed with 5 volumes of an Rluc reaction buffer

(100 mM EDTA, 50 mM Tris, pH 8.0, containing 5 μg/ml

Coelenterazine; Nanolight technology) in black-walled 96-well

microtitration plates. Following a 1 min incubation period,

luminescence was determined using a Microplate Luminometer

(Applied Biosystems).

Acknowledgments

We thank Dr. J.R. Putnak, WRAIIR, Washington, DC for

providing the anti-NS1 MAb, and Dr. R.B. Tesh of UTMB for

providing the polyclonal anti-DV1 HIMAF, and hybridoma

cells producing the E-specific Mab, D1-4G2, and I. Frolov for

supplying pBeloBAC11. We also thank I. Frolov and D.

Beasley for helpful discu ssion and suggestions. This work was

supported by a grant from NIAID to PWM through the Western

Regional Center of Excellence for Biodefense and Emerging

Infectious Disease Research (NIH grant number U54

AI057156). We also acknowledge Fundacao Oswaldo Cruz

(FIOCRUZ) and Conselho de Desenvolvimento Cientifico e

Tecnologico (CNPq, Brazil) for their support.

Appendix A. Supplementary data

Supplementary data associated with this article can be found,

in the online version, at doi:10.1016/j.virol.2006.11.026.

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483Mem Inst Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro, Vol. 103(5): 483-488, August 2008

online | memorias.ioc.fiocruz.br

Evidence for the co-circulation of dengue virus type 3 genotypes III and

V in the Northern region of Brazil during the 2002-2004 epidemics

Meri Bordignon Nogueira/

, Vanessa Stella, Juliano Bordignon, Weber Cheli Batista

Luana de Borba, Luis Hildebrando Pereira da Silva

, Federico Guillermo Hoffmann,

Christian Macagnan Probst, Claudia Nunes Duarte dos Santos/

Instituto Carlos Chagas-Fiocruz, Rua Prof. Algacyr Munhoz Maeder 3.775, Cidade Industrial, 81350-010 Curitiba, PR, Brasil

Departa-

mento de Patologia Médica

Laboratório de Virologia, Hospital de Clínicas, Universidade Federal do Parará, Curitiba, PR, Brasil

Unidade

de Virologia, Instituto de Pesquisa em Patologias Tropicais, Porto Velho, RO, Brasil

The reintroduction of dengue virus type 3 (DENV-3) in Brazil in 2000 and its subsequent spread throughout the

country was associated with genotype III viruses, the only DENV-3 genotype isolated in Brazil prior to 2002. We report

here the co-circulation of two different DENV-3 genotypes in patients living in the Northern region of Brazil during the

2002-2004 epidemics. Complete genomic sequences of viral RNA were determined from these epidemics, and viruses

belonging to genotypes V (Southeast Asia/South Pacific) and III were identified. This recent co-circulation of different

DENV-3 genotypes in South America may have implications for pathological and epidemiological dynamics.

Key words: dengue virus type 3 - genotype III and V - co-circulation - phylogenetic analysis - Amazon

Dengue is an emerging infectious disease affecting

almost 50 million people in tropical and subtropical re-

gions of the world. Dengue fever (DF) and dengue hem-

orrhagic fever (DHF) are caused by four closely related,

but antigenically different dengue virus serotypes 1-4

(DENV-1-4) (Gubler & Clark 1995). Since the introduc-

tion of the DENV into Brazil in 1986, more than four

million cases of dengue have been reported (Cordeiro et

al. 2007), and the incidence of severe clinical symptoms

has increased. No vaccine or specific therapeutic antivi-

ral measures are available.

Several studies have suggested that individuals ex-

periencing a second dengue infection with a heterolo-

gous serotype are at greater risk for developing DHF or

dengue shock syndrome (DSS) (Cummings et al. 2005,

Halstead et al. 2005). However, DHF and DSS are also

observed in primary cases, and not all secondary infec-

tions correspond to severe forms of the disease. Studies

based on molecular epidemiology have provided evi-

dence that differences in virulence between viral strains

could play a role in the severity of the disease (Mangada

& Igarashi 1998, Rico-Hesse 2003).

Major dengue virus epidemics occurred in Brazil in

1986 and 1990, due to the introduction of DENV-1 and

-2, respectively, and the subsequent spread of these se-

rotypes throughout the country. DENV-3 reappeared in

1994 in Central America (Nicaragua and Panama) after

17 years of absence, and later spread to Mexico and the

Caribbean (CDC 1995, Guzman et al. 1996, Usuku et

al. 2001). In 2000, the presence of this serotype was re-

Financial support: Fiocruz, CNPq (proc. 410593/2006-0), Fundação

Araucária (proc. 5-1-8892), CYTED/RIVE network

+ Corresponding author: clsantos@tecpar.br; clsantos@fiocruz.br

Received 11 March 2008

Accepted 4 July 2008

ported in two countries in South America: Brazil and

Venezuela (Nogueira et al. 2001, Uzcategui et al. 2003).

DENV-3 was initially isolated in December 2000 in

the state of Rio de Janeiro (RJ), in Southeastern Brazil

(Nogueira et al. 2005). The virus has since been detected

in almost all Brazilian states, establishing conditions of

hyperendemicity with serotypes 1, 2 and 3. DENV-3 gen-

otype III (Sri Lanka/India) was identified in all affected

states during the epidemics of 2001 to 2004, and caused

the one of most severe epidemic with the largest number of

reported cases, greatest severity of clinical manifestations

in primary infections in particular, and the largest num-

ber of confirmed deaths (Nogueira et al. 2005). In 2002,

Brazil contained almost 80% of the one million cases of

dengue infection in the Americas, with almost 800,000

dengue cases and 150 deaths attributed to DENV-3 (www.

saude.gov.br). Recently, Figueiredo et al. (2008) reported

the circulation of DENV-3 genotype I in Minas Gerais.

In the Amazonian state of Rondônia (RO), located in

the Northern region of Brazil, the first confirmed cases of

dengue dated from 1997, and the first outbreak occurred in

2000, with 2,759 cases (http://portal.saude.gov.br/portal/

arquivos/pdf/taxa_incidencia_dengue2007.pdf). DENV-1

was isolated in 2001 in Porto Velho (the largest city in the

state). In 2002, following the introduction of DENV-3, the

state experienced an epidemic, in which unusual clinical

symptoms, such as meningoencephalitis, were observed

(Nogueira et al. 2005, WC Batista, unpublished observa-

tions). Given the high incidence of severe clinical symp-

toms related to primary DENV infections observed in the

2002 epidemic, we decided to characterize the genome

of the virus circulating in the Northern region of Brazil

and determine its phylogenetic relationship with other

DENV-3 strains. Identification of the circulating DENV

genotypes is important, as it has been demonstrated that

some strains are more frequently associated with severe

disease than others (Leitmeyer et al. 1999, Pandey & Iga-

rashi 2000, Rico-Hesse 2003).

'HQJXHYLUXVW\SHJHQRW\SHVLQ1RUWKHUQ%UD]LO0HUL%1RJXHLUDHWDO

484

PATIENTS, MATERIALS AND METHODS

Clinical samples and viruses - A serum sample from

a dengue positive patient who had traveled to an area of

epidemic dengue in RJ in Southeastern Brazil, and eight

serum samples from patients living in Acre (AC) and RO

in Northern Brazil (Table I, Fig. 1) were kindly provided

by LACEN, Curitiba and IPEPATRO, Porto Velho, respec-

tively. All patients were diagnosed with DF. These samples

were used for the characterization of DENV genomes.

RNA extraction and RT-PCR - Viral RNA was isolat-

HGIURPȝORISDWLHQWVHUXPVDPSOHVWDNHQGXULQJWKH

DFXWHSKDVHRIWKHGLVHDVHDQGRUIURPȝORISXULILHG

virus prepared from cell culture supernatants after three

passages in C6/36 cells, as described elsewhere (Duarte

dos Santos et al. 2002). The QIAamp Viral RNA Mini Kit

(Qiagen, Valencia, USA) was used, following the manu-

facturer’s instructions. Complete genomes were amplified

E\PHDQVRIRYHUODSSLQJ573&5SURGXFWVXVLQJȝORI

RNA and random primers (Invitrogen, Carlsbad, USA)

and Improm II Reverse Transcriptase (Promega, Madi-

VRQ86$IRUKDW&ȝORIF'1$ZHUHXVHGIRU

the amplification reaction with the High Fidelity Triple-

Master® PCR System (Eppendorf, Hamburg, Germany)

and specific primers, according to the protocols supplied

with the kit. Briefly, the thermocycling conditions con-

sisted of 94ºC/3 min, followed by 35 cycles of 94ºC/30 s,

55-58ºC/30 s and 68ºC/3 min.

Sequencing strategy, multiple sequence alignment

and phylogenetic analysis - The amplicons were di-

rectly sequenced using a Thermo Sequenase kit (USB

Inc, Ohio, USA) on an ABI3100 device, with the Big-

Dye7 Terminator method (Applied Biosystems, War-

rington, UK). Nucleotide sequences were analyzed with

a Phred/Phrap/Consed package (www.phrap.org). Se-

quences were obtained from the 5’ and 3’ UTR of the BR

DEN3/290-02, BR DEN3/95-04, BR DEN3/97-04, BR

DEN3/98-04, BR DEN3/RO1-02 and BR DEN3/RO2-02

samples after uncapping and RNA ligation, as described

elsewhere (Duarte dos Santos et al. 2000). Primer se-

quences are available upon request.

Sequence analyses - For phylogenetic and compara-

tive purposes, we assembled a representative panel of

complete DENV-3 genome sequences from GenBank

(supplementary data). All sequences were aligned using

CLUSTALW (Thompson et al. 1994). Phylogenies were

estimated in a Maximum likelihood framework using

Treefinder (version April, Jobb et al. 2004). We selected

the best-fit model of nucleotide substitution based on the

TABLE I

Patient code, GeneBank accession number, origin, data, nucleotide sequence and genotype

DENV-3

Patient GeneBank State of origin/city Month/year Genome sequence/nt Genotype

BR DEN3/290-02 EF629369 RJ/Rio de Janeiro 01/2002 Complete/10707 III

BR DEN3/95-04 EF629366 AC/Rio Branco 11/200 4 Complete/10707 III

BR DEN3/97-04 EF629367 AC/Rio Branco 11/200 4 Complete/10707 III

BR DEN3/98-04 EF629368 AC/Rio Branco 11/200 4 Complete/10707 III

BR DEN3/RO1-02 EF629370 RO/Porto Velho 11/20 02 Complete/10696 V

BR DEN3/RO2-02 EF629373 RO/Porto Velho 03/2002 Partial/10324 V

BR DEN3/RO3-02 1810-3470 (EF629375) RO/Porto Velho 02/2002 Partial/7070

4300-5500 (EF629374)

6010-10220(EF629376)

BR DEN3/RO4-02 EF629371 RO/Porto Velho 08/2002 Partial/367

BR DEN3/RO5-02 EF629372 RO/Porto Velho 11/20 02 Partial/227

a: 1810-3470 (genes E and NS1), 4300-5500 (genes NS2B and NS3), 6010-10220 (genes NS3, NS4A, NS4B and NS5); b: gene C;

AC: Acre; RJ: Rio de Janeiro; RO: Rondônia.

Fig. 1: map of Brazil, showing the areas from which DENV-3 viruses

were isolated ( ) and the borders of the countries of South America.

485

Mem Inst Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro, Vol. 103(5), August 2008

Bayesian Information Criterion using the Model Propos-

al routine from Treefinder. Support for the nodes was

evaluated by running 500 bootstrap pseudoreplicates.

The likelihood scores of competing hypotheses were

obtained using the Shimodaira-Hasegawa (SH) topology

test (Shimodaira & Hasegawa 1999), as implemented in

Treefinder (Jobb et al. 2004).

RESULTS

In order to characterize the DENV strains circu-

lating in Brazil and determine their relationships with

other DENV strains, we examined clinical samples from

RO (epidemic in 2002) and AC (epidemic in 2004), and

from RJ (epidemic in 2002), located in the Northern and

Southeastern regions of Brazil, respectively. Nine DENV

isolated from human samples collected in these three

different geographical areas of Brazil were sequenced

after three passages in C6/36 cells. Complete genome se-

quences were determined for five of these viral isolates:

BR DEN3/290-02, BR DEN3/95-04, BR DEN3/97-04,

BR DEN3/98-04 (alignment of 10707 nt) and BR DEN3/

RO1-02 (alignment of 10696 nt). In addition, an almost

complete genome sequence of the BR DEN3/RO2-02

virus (starting at position 378 and ending at position

10696), as well as three fragments covering ~70% of

the genome from the BR DEN3/RO3-02 strain (corre-

sponding to positions 1810-3470, 4300-5500 and 6010-

10220) were determined. The BR DEN3/RO1-02 and BR

DEN3/RO2-02 sequences had an 11 bp deletion in the

3´UTR. We also determined partial genomic sequences

from viral RNA extracted directly from the plasma of

two Rondônian patients (BR DEN3/RO5-02, from nt

135 to 361 and BR DEN3/RO4-02, from nt 132 to 498

of DENV-3 RNA). Both samples were identified as be-

longing to genotype V. We compared complete genomic

sequences between five dengue viruses and 7070 nt

between seven dengue viruses (due mainly to the frag-

mentation of BR DEN3/RO3-02). Their nucleotide and

amino acid similarities are displayed in Table II.

Comparisons of complete genome nucleotide se-

quences showed that BR DEN3/290-02 was most similar

to BR74886/02 (99.6% identity, AY679147), which was

isolated from the liver of a patient who died from the dis-

ease in RJ (Miagostovich et al. 2002, 2006). BR DEN3/

RO1-02 was found to be closely related to 80-2 (99.7%

identity, AF317645), a virus from a DF patient isolated in

1980 in China. As can be seen in Fig. 2, the samples from

RO formed a separate cluster, which was closely related

to the DENV-3 H-87 (M93130), D3-73NIID (AB111085)

and 80-2 (AF317645) isolates, which belong to genotype

V (Southeast Asia/South Pacific), and are clearly different

from those from AC and RJ isolates, which clustered with

genotype III (Sri Lanka/India, AY099336). This finding

is remarkable, as the three genotype V viruses were iso-

lated in Asia in 1956, 1973 and 1980, respectively.

Brazilian DENV-3 isolates grouped into two separate

clides: all samples isolated from Acre grouped with an iso-

late from RJ, whereas all samples isolated from RO were

clustered in a separate clade (Fig. 2). Bootstrap support for

nodes separating the two groups of Brazilian samples was

strong (Fig. 2), and a tree where all sequences from Brazil

were clustered in a single group providing significantly

worse fit to the data (SH test p < 0.001).

DISCUSSION

A displacement of serotypes 1 and 2 of DENV was

documented in Brazil after the introduction of a highly

virulent genotype of DENV-3 (genotype III, Sri Lanka/

India) in 2002 (Nogueira et al. 2005). The rapid spread

of DENV-3 caused severe epidemics in almost all Bra-

zilian regions in the three years following its introduc-

tion (Nogueira et al. 2005, De Simone et al. 2004). The

Northern region of Brazil suffered DENV-3 epidemics

between 2002 and 2004. Different clinical profiles were

observed during this epidemic period, with DHF/DSS

and encephalitis cases identified in RO, whereas only DF

was observed in AC. During the DENV-3 epidemic in RO

in 2002, several atypical encephalitis cases were observed

in patients testing positive serologically for dengue, but

it was not possible to isolate virus from those patients. It

remains unclear whether that clinical pattern was exclu-

sively related to DENV-3, or was the result of co-infection

with other viruses, such as the SLE or Rocio viruses (Roc-

co et al. 2005, Mondini et al. 2007). However, we cannot

exclude the possibility that the observed unusual clinical

presentations were exclusively due to the DENV infec-

tions, taking into account the results of Domingues et al.

(2008) which showed that 21.2% of patients with dengue

infection exhibited involvement of the central nervous

system. In AC, DENV-3 was first isolated in 2004 and no

severe case was observed at that time (Brazilian Ministry

of Health, SVS, www.saude.gov.br).

We compared viral genomes amplified directly from

serum samples or from insect cells infected with viruses

TABLE II

Nucleotide (bottom) and amino acid (top) similarity between brazilian dengue virus type 3 (BR DEN3) isolates

described in this paper

DEN3/95-04 DEN3/98-04 DEN3/290-02 DEN3/97-04 DEN3/RO2-02 DEN3/RO1-02 DEN3/RO3-02

DEN3/95-04 99.9 99.9 99.6 98.1 98.1 98.1

DEN3/98-04 99.9 99.8 99.6 98.1 98.1 98.1

DEN3/290-02 99.6 99.6 99.7 98.1 98.1 98.1

DEN3/97-04 99.4 99.4 99.5 97.9 97.9 97.9

DEN3/RO2-02 94.5 94.5 94.5 94.4 100.0 100.0

DEN3/RO1-02 94.5 94.5 94.5 94.4 100.0 100.0

DEN3/RO3-02 94.5 94.5 94.5 94.4 100.0 100.0

'HQJXHYLUXVW\SHJHQRW\SHVLQ1RUWKHUQ%UD]LO0HUL%1RJXHLUDHWDO

486

circulating in Northern Brazil, samples of DENV-3 from

RJ, and those retrieved from databases. It should be em-

phasized that only DENV-3 genotype III was identified

during the 2002 to 2003 epidemic in samples from Porto

Velho (Aquino et al. 2006) and RJ (Nogueira et al. 2005),

and this genotype is the only one to have been implicat-

ed in DENV-3 epidemics in the Americas (Usuku et al.

2001, Messer et al. 2003, Uzcategui et al. 2003, Peyrefitte

et al. 2005, Rigau-Pérez & Laufer 2006, Ocazionez et al.

2006). When samples received from Porto Velho were

used to infect C6/36 cells, they displayed a cytotoxic ef-

fect not seen with other DENV-3 viral isolates (data not

shown). These findings led to the molecular character-

ization of these samples. Viral genome sequences of five

isolates indicated that DENV-3 genotypes III and V co-

circulated during the 2002 epidemic in RO. We analyzed

three samples from AC, all of which were of genotype

III, as well as the isolate from RJ. However, due to the

small number of samples studied, we cannot rule out the

possibility that another genotype was also circulating in

those regions. The virus collection of our institute (ICC-

Fiocruz) does not include DENV-3 strains H87 (M93130,

Osatomi & Sumiyoshi 1990), 80-2 (AF317645), or any

other DENV-3 genotype V strain, and these strains had

never been manipulated in our laboratories. Sample

contamination was therefore highly unlikely. Further-

more, two of the eight samples from RO and seven of

the 12 samples from AC tested negative. Moreover, vi-

ral RNA for BR DEN3/RO4-02 and BR DEN3/RO5-02

was obtained directly from plasma samples. It is worth

mentioning that our data was recently corroborated

by similar findings in Colombia (José Usme Ciro and

Juan Carlos Gallego-Gómez, unpublished observations)

which showed that DENV-3 genotype V had also been

isolated from human cases in Colombia during the 2003-

2005 epidemics.

Aquino et al. (2006) recently demonstrated by phylo-

genetic analysis with partial nucleotide sequences for the

E protein and 3’UTR that Brazilian DENV-3 (particular-

ly from RO) are grouped with samples from Sri Lanka,

Samoa and other American genotype III DENV-3. These

authors also suggested that DENV-3 had been introduced

at least twice into Brazil, once via RJ and the second via

the Caribbean countries. More recently, Figueiredo et al.

(2008) demonstrated the co-circulation of two genotypes

of DENV-3 in Minas Gerais from 2002 to 2004. A larger

number of viral isolates should be analyzed in other Bra-

zilian states and South American countries to identify

the circulating dengue genotypes, and to track the dy-

namics of virus introduction and maintenance in nature.

The DENV-3 genotype classification is a controversial

matter. Wittke et al. (2002) have re-classified the China

Fig. 2: maximum likelihood phylogram describing phylogenetic relationships among the Brazilian DENV-3 isolates and the reference panel

based on the complete genome nucleotide sequences. Brazilian samples are in italics and in bold. Bootstrap values are provided next to the

relevant nodes. GenBank accession numbers of all virus strains included in this analysis are listed in the supplementary data.

487

Mem Inst Oswaldo Cruz, Rio de Janeiro, Vol. 103(5), August 2008

80-2 strain, formerly classified as genotype I, as geno-

type V based on E gene sequences. Aquino et al. (2006)

have followed this classification. On the other hand,

Figueiredo et al. (2008), using C/prM gene sequences,

classified the same strain as belonging to genotype I. We

decided to adopt the Wittke et al. (2002) classification

as it provided a higher level of genotype discrimination.

Following this, we classified our strains as belonging to

genotypes III (AC) and V (RO). However, we acknowl-

edge that DENV-3 genotype classification is still con-

troversial. Intra-serotype genetic diversity in DENV

vary greatly on a temporal scale, and it has became clear

that individual lineages or entire virus clades frequently

arise, persist for a period of time, and then disappear

(Zhang et al. 2005). Therefore, more precise criteria for

genotype classification of dengue virus are essential to

avoid different nomenclature for similar strains.

The results obtained in this study raise some intrigu-

ing questions: how can a recent clinical viral isolate

from South America display 99.9% identity with a labo-

ratory viral strain (DENV-3 80-2) isolated from a DF

patient in China? Will it be possible to trace the route by

which these viruses entered the Americas? Interestingly,

the DENV-3 genotype V strains H-87 (L11423) isolated

from a human case in the Philippines in 1956, D3-73NI-

ID (AB111085) isolated in 1973 from an imported human

case in Japan, and 80-2 (AF317645) isolated in China

in 1980, also display a remarkably high level of nucle-

otide sequence conservation (over 99%) with each other

and with some of the viruses included in this study. The

most dramatic case of sequence similarity is illustrated

by the three viral isolates from RO; they display 100%

sequence identity with each other. These three cases are

probably linked epidemiologically, but further efforts

are needed to elucidate whether they represent a single

chain of infection.

Further genome characterization of viruses from other

South American countries that have also experienced un-

usual DENV-3 epidemics should shed light on this issue.

ACKNOWLEDGEMENTS

To Paulo Arauco for technical help with sequencing and

Anaclete Felinni, from LACEN-Curitiba, for the dengue se-

rum samples.

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Journal of Clinical Virology 45 (2009) 153–156

Contents lists available at ScienceDirect

Journal of Clinical Virology

journal homepage: www.elsevier.com/locate/jcv

Case report

Evidence of circulation of Laguna Negra-like hantavirus in the Central West of

Brazil: Case report

Sonia Mara Raboni

a,b

, Luana de Borba

, Federico G. Hoffmann

, Lucia de Noronha

Marin Luize Viola Azevedo

, Suzana Carstensen

, Giovanny A.C.A. Mazzarotto

Juliano Bordignon

, Claudia Nunes Duarte dos Santos

a,∗

Instituto Carlos Chagas, ICC/Fiocruz/PR, Brazil

Universidade Federal do Paraná, Brazil

Centro de Ciências Biológicas e da Saúde, PUCPR, Brazil

article info

Article history:

Received 13 March 2009

Accepted 23 March 2009

Keywords:

Hantavirus pulmonary syndrome

Genetic characterization

Phylogeny

Laguna Negra-like virus

abstract

Background: Hantavirus pulmonary syndrome has been reported with increasing frequency in some

Brazilian regions, but information about viral genetic identiﬁcation is still limited. Recently, the state

of Mato Grosso, in the Legal Amazon of Brazil, experienced a growing number of hantavirus pulmonary

syndrome (HPS) cases but the genetic characterization of the causative hantavirus is still missing.

Objectives: Our goal was to identify the hantavirus strain involved in a fatal HPS case in the Central region

of Brazil.

Study design: Nested RT-PCR was conducted on blood clot samples from an HPS patient from Mato Grosso.

PCR-positive samples were sequenced, and the resulting sequences were compared with reference sam-

ples. Viral antigens were detected by immunohistological analyses in lung and liver tissues.

Results: Analyses of the viral RNA isolated from the patient identiﬁed a Laguna Negra (LN)-like virus as

the causative agent and histological analysis of lung sections were compatible with the genetic charac-

terization.

Conclusions: This is the ﬁrst report of circulation and human infection by a Laguna Negra-like hantavirus

in Brazil.

1. Background

Hantaviruses are serologically related members of the family

Bunyaviridae that occur worldwide in association with rodents and

insectivore carriers. These viruses have been linked with two dis-

tinct diseases: hemorrhagic fever with renal syndrome (HFRS) and

hantavirus pulmonar y syndrome (HPS).

In Brazil, a surveillance program was implemented in 1993 to

monitor HPS cases.

Afterwards, evidence for hantavirus infection

was described in various regions. In order to identify the hantavirus

strain involved with human infections, rodents have been sampled

in diverse ecosystems and these studies have uncovered signiﬁcant

genetic diversity among the viruses described. Four different han-

taviruses have been associated with HPS cases in Brazil so far, all of

them associated with rodent species as hosts. Juquitiba-like virus

is associated with Oligoryzomys nigripes and is found in the Atlantic

∗

Corresponding author at: Instituto Carlos Chagas, ICC/Fiocruz/PR, Rua Prof. Alga-

cyr Munhoz Mader 3775, CIC, 81350 010, Curitiba, PR, Brazil. Tel.: +55 41 316 3230;

fax: +55 41 316 3267.

E-mail address: clsantos@tecpar.br (C.N. Duarte dos Santos).

rainforest and in the south and southeast, Araraquara virus is asso-

ciated with Necromys lasiurus and is found in the savanna (cerrado)

region and the central plateau, Castelo dos Sonhos virus is associ-

ated with Oligoryzomys moojeni and occurs in the Amazon region,

and Anajatuba virus is associated with Olygoryzomys fornesii and is

detected in the northeastern region.

3–10

The state of Mato Grosso is located in the central west region

of Brazil, it is part of legal Amazon and in its west borders Bolivia.

Most of the state is covered by equatorial forest. In the west region

the cerrado, formed by trees up 10 m high used to predominate.

However, the cerrado has now been replaced by agricultural pro-

duction and pasture in large parts of the state. Human population

in the region has grown sharply in the last decade because of migra-

tion. Associated with the increase in human population, a growing

number of HPS cases have been noted by the Brazilian Ministry of

Health.

2. Objectives

The objective of this study is identifying the hantavirus strain

related to a fatal HPS case in Mato Grosso state, Brazil and

doi:10.1016/j.jcv.2009.03.015

Author's personal copy

154 S.M. Raboni et al. / Journal of Clinical Virology 45 (2009) 153–156

determined its phylogenetic relationship with circulating South

American hantaviruses.

3. Study design

Serum and clot samples from a patient with suggestive symp-

toms of hantavirus infection were tested using speciﬁc IgM and

IgG antibody assays (ELISA) and RT-PCR for viral RNA detection.

Partial viral genomic S segment was sequenced and genotyped

by phylogenetic reconstruction. In addition, histopathological and

immunohistochemical studies were performed in tissues sections

of lung and liver aiming to characterize the main target sites during

hantavirus infection.

4. Results

The patient was a 19-year-old man farm worker, previously

healthy, who lived in Campo Novo do Parecis, in the west of

Mato Grosso (13

◦





S57

◦





W). He was admitted to hospi-

tal reporting 3 days of ﬂu-like symptoms, and after hospitalization,

he developed malaise, high fever, myalgia, headache, dry cough,

tiredness, dispnea, back pain, nausea, vomits, abdominal pain and

diarrhea. The initial treatment was intravenous administration of

one liter of normal saline solution and symptomatic drugs. Due

to ongoing hypotension and hypoxia, the patient was maintained

with oxygenoterapy. Vasopressors and inotropes drugs were used

to uphold blood pressure and cardiac output. Three hours after his

admission at the hospital, he had an asystolic cardiac arrest and

resuscitation efforts were unsuccessful.

In the postmortem examination, the main histopathological

features were seen in the lung, where microscopic examination

revealed a moderate interstitial pneumonitis with evidence of

marked pulmonary edema and very mild and focal lymphoid inﬁl-

trate. Extensive amounts of edema ﬂuid were seen within the

alveoli. Vascular thrombi, endothelial cell necrosis, focal hemor-

rhages, ischemic necrosis lesions, cellular responses of neutrophils

and respiratory epithelium lesions were absent. Morphological

changes of the endothelium, when present, consisted of swollen

endothelial cells. Microscopic examination of the liver revealed a

severe degree of congestion and clusters of hypertrophic and hyper-

plasic Kupffer cells.

Liver and lung tissues were analyzed by immunohistochem-

istry (IH) assays; the sections of parafﬁn-embedded tissues were

stained with monoclonal antibody to JUQ-like virus (also known as

ARAUV) nucleoprotein and a polymer-HRP anti-mouse secondary

antibody (Envision

+®

System, DakoCytomation, Inc., CA, USA). The

speciﬁcity of IH staining was conﬁrmed by replacing ﬁrst antibodies

with phosphate-buffered saline (PBS) or isotypes-identical murine

antibodies and a ﬂavivirus monoclonal antibody (4G2). Control tis-

sues included hantavirus infected cells as well as non-HPS autopsy

tissues. Viral nucleoproteins were detected in the cytoplasm of the

endothelial cells and in inﬁltrated mononuclear cells from lung

(Fig. 1).

Serologic examination of blood samples, using JUQ-like virus

recombinant nucleoprotein antigen

were positive for IgM and

IgG. Viral RNA was extracted from blood clot using the High Pure

Viral RNA kit (Roche Inc., Mannhein, GE), PCR products were synthe-

sized by nested reverse transcriptase-PCR, primers were selected to

amplify S and M segments, as previously reported.

12,13

One genomic

fragment that covers the complete coding sequence of the nucle-

ocapsid protein gene from the S segment was obtained (1.584 bp).

The ampliﬁed PCR product was puriﬁed using Wizard PCR Preps.

(Promega, Madison, WI, USA), and cloned into the pGEM-T easy

vector (Promega, Madison, USA). Four independent clones were

sequenced using an ABI 310 instrument. The nucleotide sequence

had been deposited in the GenBank under the accession number

Fig. 1. Pathological ﬁndings in lung and liver tissues of a fatal case of HPS (A), and immunohistochemistry reaction (B). Hematoxilin–eosin reaction demonstrated severe

capillary congestion (arrow) and extensive edema ﬂuid in alveoli (*) (A-a). In the liver a severe degree of microvasculature congestion is noted (arrows) (A-b). The immuno-

histochemistry reaction conﬁrms the HPS diagnosis, as demonstrated by the positive reaction with JUQ-like virus Mab 313/11E in contrast with the reaction using the isotype

control 4G2 Mab (anti-ﬂavivirus group-speciﬁc) (B-b and B-a).

Author's personal copy

S.M. Raboni et al. / Journal of Clinical Virology 45 (2009) 153–156 155

Fig. 2. Panel A. Neighbor-joining tree based on an 1.287 bp alignment of the complete coding sequence of the gene encoding for the nueclocapsid protein (N), depicting

phylogenetic relationships between viral sequences from the human patient in our study (HMT 08/02), and a reference panel obtained from Genbank. Panel B. Neighbor-

joining tree based on a 291-basepairs alignment of the gene encoding for the nueclocapsid protein (N), depicting phylogenetic relationships between viral sequences from the

human patient in our study (HMT 08/02), and a reference panel obtained from Genbank, with 3 additional sequences from Carroll et al.

In the two cases sequences collected

in the human patient HMT 08/02 were similar to sequences from the Laguna Negra virus (from western Paraguay and Bolivia). Sequences were aligned with ClustalW

and in MEGA version 4

using the maximum composite likelihood estimates of the Tamura-Nei distance.

21,22

Support for the nodes was evaluated with 1000 bootstrap

pseudoreplicates.

FJ816031. A comparison of the sequence from nucleocapsid gene

showed that the closest match to the new sequence was the Laguna

Negra virus, which was 86% similar at the nucleotide level, and 96%

at the amino acid level. These results were conﬁrmed by neighbor-

joining phylogenies (Fig. 2).

Experiments involving human samples were approved by Eth-

ical Committee from Brazilian Ministry of Health (CONEP) under

protocol no. 10573.

5. Discussion

In Brazil, despite the increasing training of medical personnel

to recognize the clinical symptoms of HPS, mortality rate is still

high (∼40%). The demarcation of hantavirus transmission areas and

the characterization of circulating virus should contribute to better

direct control measures. To identify its causative agent, we studied

a fatal HPS case from the state of Mato Grosso, in the central region

of Brazil. This area is of special interest because it presents a grow-

ing number of hantavirus infections, and borders Bolivia, where

hantavirus circulation is well documented.

14–16

In an ecological assessment in Santa Cruz, Bolivia, Carroll et al.

found two rodent species with antibodies for hantavirus, Oligory-

zomys microtis and Calomys callosus. The viral nucleotide sequences

isolated from two C. callosus were 87–88% similar to the Laguna

Negra virus and 99% identical to viral sequences obtained from HPS

patients in this area, implicating C. callosus as the host of Laguna

Negra virus. More recently, IgG anti-hantavirus positive Calomys

launcha rodents were detected in Mato Grosso.

Our phylogenetic

analysis from the hantavirus of a fatal HPS case grouped this virus

with the Laguna-Negra hantavirus (Fig. 2).

The observed pulmonary histopathological features arein agree-

ment with those described by Zaki et al.

consisting of an

interstitial pneumonitis with a variable mononuclear cell inﬁl-

trate, edema, and focal hyaline membranes. IHC analysis showed

widespread presence of hantaviral antigens in endothelial cells of

the microvasculature in the lung. Hantaviral antigens were also

observed within follicular dendritic cells, macrophages, and lym-

phocytes.

In this report we conﬁrmed the circulation of a Laguna Negra-

like hantavirus virus in the west of Brazil and emphasize the

importance of monitoring the seroprevalence for hantaviruses in

rodent hosts from different regions of Brazil. In addition, the genetic

characterization of the involved viruses, is critical to implementing

adequate control measures to protect the exposed populations in

regions which were previously free of hantavirus infection.

Conﬂict of interest

The authors have declared that no competing interests exist.

Acknowledgments

We are indebted with Gisélia Rubio from Departamento

de Vigilância, SESA-PR and Irene Skraba from LACEN-PR. The

authors thank CNPq, CNPq/Prosul, Fiocruz, Fundac¸ ão Araucária,

CYTED/RIVE and Fundo Paraná for ﬁnancial support. LB, FGH, SC,

GACA, JB and CNDS are CNPq fellowship recipients.

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Contents lists available at ScienceDirect

Journal of Virological Methods

journal homepage: www.elsevier.com/locate/jviromet

Short communication

Construction and characterization of a stable subgenomic replicon system of

a Brazilian dengue virus type 3 strain (BR DEN3 290-02)

Ana Luiza Pamplona Mosimann

, Luana de Borba

, Juliano Bordignon

Peter W. Mason

, Claudia N. Duarte dos Santos

a,∗

Instituto Carlos Chagas-Fiocruz/PR, Rua Prof. Algacyr Munhoz Mader, 3775 Curitiba, Paraná, Brazil

Department of Pathology, University of Texas Medical Branch, 3.206B Mary Moody Northen Pavilion, 301 University Boulevard, Galveston, TX 77555-0436, USA

Article history:

Received 15 May 2009

Received in revised form 25 August 2009

Accepted 7 September 2009

Available online 15 September 2009

Keywords:

Flavivirus

Dengue virus serotype 3

Replicon

abstract

Dengue viruses (DENV) cause the most common arboviral disease afﬂicting men. Clinical manifestations

range from asymptomatic to dengue hemorrhagic fever/dengue shock syndrome (DHF/DSS). The mech-

anisms involved in the disease pathogenesis are not fully understood. The severity of the disease seems

to be inﬂuenced by both viral and host factors. Subgenomic replicons of DENV can be used to study

viral replication mechanisms and evaluate the effects of antiviral drugs on viral replication. The objective

was to generate and characterize biologically a replicon from a clinical isolate of DENV-3, as part of our

studies to understand how this new isolate interacts with cells. To obtain this replicon several RT-PCR

fragments encoding the non-structural proteins genes were cloned in high-copy vectors, and used to

assemble the replicon in a BAC plasmid vector containing a synthetic DNA molecule encoding the 5



and



ends of a viral cDNA with a T7 DNA-dependent RNA polymerase promoter and a ribozyme. In vitro

transcribed RNA recovered from this BAC plasmid was transfected into C6/36 mosquito cells, and dengue

virus protein expression was assessed by indirect immunoﬂuorescence using polyclonal antibodies. The

results showed that the replicon was replicated efﬁciently in cells, demonstrating successful assembly

of a DENV-3 replicon.

Dengue viruses (DENV) are the causative agent of the most

prevalent arthropod-borne viral disease afﬂicting mankind. These

viruses belong to the genus Flavivirus, family Flaviviridae and are

single-stranded RNA viruses with a genome of approximately 11 kb

in length. The viral genome contains two terminal untranslated

regions (UTRs) and encodes for three structural (C, prM and E)

and seven non-structural proteins (NS1, NS2A, NS2B, NS3, NS4A,

NS4B and NS5) which are translated into a polyprotein that is pro-

cessed by viral and host proteases (Chambers et al., 1990). DENV

are classiﬁed immunologically in four different serotypes: DENV-

1, DENV-2, DENV-3 and DENV-4, all of which have the potential

to cause disease in man. The spectrum of clinical manifestations

is broad and can range from an asymptomatic infection to dengue

hemorrhagic fever/dengue shock syndrome (DHF/DSS). The mecha-

nisms involved in the disease pathogenesis are not well understood

and are still a challenge. The severity of clinical presentation

seems to result from both viral factors and host immune response

(Halstead et al., 1973; Halstead and O’rourke, 1977; Rosen, 1977;

Mongkolsapaya et al., 2003). No speciﬁc treatments or licensed vac-

∗

Corresponding author. Tel.: +55 41 33163234; fax: +55 41 33163267.

E-mail address: [email protected] (C.N.D.d. Santos).

cines are available to treat or prevent dengue. In this manuscript the

construction of a subgenomic replicon from a DENV-3 strain that

has emerged recently in South America is described. This replicon

should be useful for studying many aspects of DENV-3 replication,

and will be valuable for the development of a reverse genetics

system that should aid in our studies to understand this newly

emerged strain of DENV-3.

Replicons have all the elements needed for the replication of

the viral genetic material in cells, but do not encode the func-

tional structural proteins and consequently are not able to generate

new viral particles (Jones et al., 2005a). Among the Flaviviruses the

only viruses for which subgenomic replicon systems have been

reported are: DENV-2 (Pang et al., 2001; Alvarez et al., 2005a;

Jones et al., 2005b; Holden et al., 2006; Ng et al., 2007), DENV-1

(Suzuki et al., 2007), Yellow fever virus (Corver et al., 2003; Jones

et al., 2005a), Kunjin virus (Khromykh and Westaway, 1997), Tick-

borne encephalitis virus (Gehrke et al., 2003), Japanese encephalitis

virus (Yun et al., 2007), Omsk hemorrhagic fever virus (Yoshii and

Holbrook, 2009) and West Nile virus (Yamshchikov et al., 2001;

Shi et al., 2002; Scholle et al., 2004; Rossi et al., 2005)(Table 1).

Currently these replicons represent powerful research instruments

and are being used to help deﬁne the role of mutations in the non-

structural proteins (Suzuki et al., 2007), to study viral replication

doi:10.1016/j.jviromet.2009.09.004

148 A.L.P. Mosimann et al. / Journal of Virological Methods 163 (2010) 147–152

Table 1

Flavivirus replicons.

Virus Vector Bacterial or

yeast strain

Promoter Extra 5



and 3



nucleotides



E Ribozyme Structure of the reporter

gene/Resistance gene

(location)

CPE Cell RNA introduction References

KUNV pBR322 DH5␣ SP6(+G) Yes (5



and 3



) 321 nt or

60 nt

66 nt No IRES-CAT or IRES-NEO



UTR76)

No BHK-21 Electroporation Khromykh and

Westaway (1997)

WNV pBR322 HB101 SP6(+G) Yes (5



and 3



) 69 nt X No No Yes BHK-21 Electroporation Yamshchikov et

al. (2001)

DENV2 pBR424 STBL2 and

YPH857

SP6 or CMV X 363 nt or

60 nt

72 nt Yes/No No X LLC-MK2 Electroporation Pang et al. (2001)

WNV pBR322 HB101 T7(+G) No 93 nt 90 nt No IRES-GFP or IRES-NEO



UTR)

No BHK-21 Electroporation Shi et al. (2002)

TBEV pBR322 HB101 T7(+G) Yes (5



) 300 nt or

81 nt

69 nt No No No BHK-21 Electroporation Gehrke et al.

(2003)

YFV pBeloBAC11 X SP6 X 291 nt, 150

nt or 60 nt

X No No X BHK-21 Lipofectamine Corver et al.

(2003)

WNV X X T7 X 93 nt X No IRES-tat-2A-NEO or

IRES-GFP-2A-NEO



UTR)

X BHK-21 Electroporation Scholle et al.

(2004)

WNV pACNR X T7 Yes (3



) X X Yes IRES-tat-2A-NEO,

IRES-LUC-2A-NEO or

IRES-GFP-2A-NEO



UTR)

X BHK-21,

Vero and

Huh7

Electroporation Rossi et al. (2005)

YFV pACNR X SP6(+G) Yes (5



and 3



) 63 nt 72 nt No IRES-GFP, IRES-LUC or

IRES-NEO



UTR)/GFP-2A or

LUC-2A (C-ssNS1)

No or

little

BHK- 15 Electroporation Jones et al.

(2005a)

DENV2 pBR322 X T7 Yes (3



) 102 nt 72 nt No LUC-2A (C-ssNS1) X BHK-21

and C6/36

Lipofectamine Alvarez et al.

(2005a)

DENV2 pWSK29 DH5␣ T7(+G) Yes (5



and 3



) 81 nt 72 nt No PAC-2A (C-ssNS1) X K562 and

THP-1

X Jones et al.

(2005b)

DENV2 pBR322 X T7 No 72 nt 90 nt Yes LUC-2A (C-ssNS1) X BHK-15 Lipofectamine Holden et al.

(2006)

DENV1 pACNR and

pBeloBAC11

X T7(+G) Yes (5



) X X Yes/No No or IRES-LUC



UTR169)

X BHK-21 Electroporation Suzuki et al.

(2007)

DENV2 pWSK29 Top10 T7(+G) Yes (5



or 5



and



)

66 nt 72 nt Yes/No PAC-2A-GFP-IRES or

PAC-2A-LUC-IRES

(C-ssNS1)

X BHK-21 Electroporation Ng et al. (2007)

JEV pBeloBAC11 X SP6(+G) Yes (5



No IRES-LUC, IRES-LacZ or

IRES-GFP (3



UTR)

X BHK-21 Electroporation Yun et al. (2007)

OHFV pACNR X T7(+G) Yes (5



) 81 nt 69 nt Yes GFP-2A or LUC-2A

(C-ssNS1)

No BHK-21 TransIT-mRNA Yoshii and

Holbrook (2009)

X = no information available: 5



C = number of nucleotides coding for the 5



end of the C protein that were retained; 3



E = number of nucleotides coding for the 3



end of the E Protein that were retained; nt = nucleotides; 3



UTR = gene

insertion at the 3



UTR; C-ssNS1 = gene insertion at the junction of the retained capsid and NS1 signal sequence;  = deletion; DENV = Dengue virus; JEV = Japanese encephalitis virus; KUNV = Kunjin virus; OHFV = Omsk hemorrhagic

fever virus; TBEV = Tick borne encephalitis Virus; WNV = West Nile virus; YFN = Yellow fever virus;2A = autoproteolytic peptide from foot and mouth disease virus; CAT = chloramphenicol acetyltransferase; GFP = green ﬂuorescent

protein; IRES = Internal ribosome entry site; LacZ = ␤-galactosidase; LUC = luciterase; NEO = neomycin phosphotransferase; PAC = puromycin n-acetyltransferase.

These authors deleted or completely the ectodomins of the structural proteins and maintained all or part of their tansmembrance dominos.

A.L.P. Mosimann et al. / Journal of Virological Methods 163 (2010) 147–152 149

(Alvarez et al., 2005a; Alvarez et al., 2005b; Bredenbeek et al., 2003)

and to test antiviral drugs (Holden et al., 2006; Ng et al., 2007; Rossi

et al., 2005). They are also being used in the development of differ-

ent genetic vaccines based on self-replicating non-infectious RNA,

either through the expression of heterologous genes or through the

partial expression of its structural genes (prM-E) (Koﬂer et al., 2004;

Ishikawa et al., 2008; Widman et al., 2008).

The objective of this work was to construct and character-

ize biologically a replicon generated from a recent clinical isolate

of a Brazilian dengue virus serotype 3 (GenBank accession no.

EF629369, BR DEN3 290-02 BR) (Nogueira et al., 2008). The choice

of this serotype was due to its predominance in Brazil in the last

epidemics (Ministério da saúde, 2006; Ministério da Saúde, 2007,

2008a). Furthermore, the introduction of this new DENV-3 into

Brazilian territory in 2000 (Nogueira et al., 2007) coincided with

a raise in the disease severity and fatalities (Ministério da saúde,

2008b). To our knowledge this is the ﬁrst description of a DENV-3

replicon, the main advantage of which is to provide the best back-

ground for testing differences in the non-structural region that are

peculiar to serotype 3 viruses.

The ﬁrst step to produce this replicion was to amplify by

RT-PCR the different segments of the BR DEN3 290-02 strain using

high-ﬁdelity enzymes (ImProm-II

Reverse Transcription System,

Promega, Madison, WI, USA and TripleMaster

PCR System, Eppen-

dorf, Westbury, NY, USA). The sequence of the primers (5



→ 3



)

used for RT-PCRs are: D3.7: GGAGTTCTCTTGACTTGG, D3.29:

GCAATTGCTCCTATTTCCCCTG, U449: CTGAAACGCGTGAAAAACA-

CATCCATGTCATTTTCATGC, D3.10: CATGGGAGGAAGAGGCTGAGC,

D3.27: CTTCCCAGGTGATCCTTCCCAGAG, D3.28: GGAAGAGTGC-

CTTCACACCTAGCCC, D3.15: GTCACCATGGGCACCACATCCC, D3.37:

AAGTGTGACACCCTGTTGTGTGAC, D3.17: CGTCCTGGGGTCT-

GCAGGG. The resulting segments named D3.7/D3.29, D3.10/D3.27,

D3.28/D3.15 and D3.37/D3.17 (see Fig. 1) have been inserted

in high-copy plasmids (pGEM

-T and pGEM

-T-easy, Promega,

Madison, WI, USA). Potential clones were identiﬁed using the

toothpick technique (Barnes, 1977) and their identity conﬁrmed

by restriction reactions with SacII (New England Biolabs, Ipswich,

MA, USA) and SacI endonucleases (Amersham Biosciences, Little

Chalfont, UK). All positive clones were fully sequenced and used

to assemble the replicon in the #50pBAC vector. The U449/D3.6

RT-PCR fragment (Fig. 1) was cloned directly in a low copy plasmid,

#49pAC. The two low-copy vectors #49pAC and #50pBAC used

in this study are derived from the plasmids pACDV1poly and

pBACDV1poly, respectively, developed by Suzuki et al. (2007).

Both were modiﬁed so that a synthetic DNA cassette was inserted

between BamHI/SwaI restriction sites in the pACDV1poly and

NotI/SwaI in the pBACDV1poly (Bio Basic Inc., Markham, ON,

Canada). This synthetic cassette comprised a NotI restriction

site, the T7 RNA polymerase promoter sequence plus a G, the



UTR, the ﬁrst 56 nucleotides coding for the capsid protein of

the BR DEN3 290-02 BR strain, a multiple cloning site (MluI, XhoI,

AﬂII/BspTI, XmaI/SmaI, NheI, AvrII, SphI, NruI, EcoRV and ClaI),

the 693 nucleotides coding for the C-terminal portion of the NS5

protein and the 3



UTR of BR DEN3 290-02 strain followed by the

hepatitis delta virus ribozyme sequence and a SwaI restriction

site. The choice for low copy plasmids was based on previous

reports describing insert instability during the construction of

ﬂaviviruses infectious clones and replicons (Gritsun and Gould,

1998; Hurrelbrink et al., 1999; Pierro et al., 2006; Shi et al., 2002;

Suzuki et al., 2007; Yun et al., 2003). This strategy is believed

to circumvent cloning instability and to diminish potential toxic

effects related to the cloning of these genomes.

All nucleotide sequencing was performed using the BigDye

Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied Biosystems, Fos-

ter City, IA, USA) in a ABI PRISM

3100 Genetic Analyzer (Applied

Biosystems, Foster City, IA, USA). The strategy used to assemble

the DENV-3 replicon is illustrated in Fig. 1. Basically it consisted

of serial subcloning procedures into low-copy vectors of the frag-

ments comprising the NS1 signal-sequence and all non-structural

proteins that had been cloned previously in the high-copy vec-

tors. The structural coding region is absent in the ﬁnal construct

except for the ﬁrst 56 nucleotides coding for the C protein, which

play an important role in the RNA cyclization and are essential for

the replication to occur (Bredenbeek et al., 2003; Lo et al., 2003;

Alvarez et al., 2005a). This C fragment is fused in frame to the NS1

signal sequence, which is coded in the C-terminal of the E pro-

tein, followed by the sequence of all non-structural proteins (NS1

to NS5), the 3



UTR and the sequence corresponding to the hepati-

tis delta virus ribozyme. The ribozyme assures correct processing

of the 3



end. All cloning procedures were done according to stan-

dard procedures using Top10 and Top10F



E. coli strains (Invitrogen,

Carlsbad, CA, USA). All plasmid DNA puriﬁcations were done using

Fig. 1. Schematic representation of the strategy used for the DENV-3 replicon assembly. The BR DEN3 290-02 strain genome is schematically represented in black and white

and the enzymes used in the cloning procedures are depicted above it. The steps involved in the replicon assembly are represented below. First the ampliﬁed RT-PCR segments

(white boxes in bold) were cloned in high-copy vectors (pGEM-T and pGEM-T easy) and then subcloned in low-copy vectors (#49pAC and #50pBAC) as shown. The ﬁnal

construct is represented in the dashed-line box and the intermediate constructs from which it originated are represented above and below it.

150 A.L.P. Mosimann et al. / Journal of Virological Methods 163 (2010) 147–152

Fig. 2. Immunoﬂuorescence of the C6/36 cultures transfected with the replicon clone BR DEN3 290-02. For immunoﬂuorescence the cells were ﬁxed and incubated with

DENV-3 polyclonal antibody followed by anti-mouse conjugated to FITC. Pictures were taken with 200× magniﬁcation factor and the scale bar in the bright ﬁeld pictures

corresponds to 100 ␮m.

the Wizard

Plus SV Minipreps DNA Puriﬁcation System (Promega,

Madison, WI, USA) according to manufacturer’s recommendations.

Top10 and Top10F



strains were chosen because of their recA1

genotype which makes these strains less prone to recombination.

To assess whether the replicon was functional, it was linearized

with the SwaI restriction enzyme downstream of the ribozyme

(Supplementary Fig. 1), and the resulting template was transcribed

in vitro using the MEGAscript

T7 High Yeld Transcription Kit

(Ambion, Austin, TX, USA) in the presence of the m

G(5



)ppp(5



cap analog (New England Biolabs, Ipswich, MA, USA). The in vitro

synthesized RNA was used to transfect C6/36 mosquito cells with

lipofectin (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA). Viral RNA isolated from

the supernatant of cell cultures infected with the BR DEN3 290-

02 strain was transfected in the same way and used as a positive

control. Non-transfected cells were used as a negative control

(mock). At different time points (48, 72, 96 and 120 h) posttransfec-

tion the supernatants were removed, the cells ﬁxed and analyzed

by indirect immunoﬂuorescence assay using DENV-3 polyclonal

antibodies (␣-DENV-3) or scraped, lysed and subjected to RNA

extraction using the RNeasy kit (QIAGEN, Valencia, CA, USA) and

used in quantitative PCR (qPCR) experiments as described by

Poersch et al. (2005). The supernatants from the transfected cul-

tures were titrated to check for virus particles formation by the

focus immunodetection technique (Dèspres et al., 1993).

As shown in Fig. 2, the cells transfected with either the viral

or synthetic replicon RNAs showed positive reaction with DENV-3

polyclonal antibody. From these results it can be concluded that

the RNAs were transfected efﬁciently and translated into proteins

that could be recognized by the speciﬁc antibody. A raise in the

number of positive cells with time could also be observed. This

raise was clearly more pronounced in the cultures transfected with

the positive control RNA, as expected, but it could also be seen in

the cultures transfected with the replicon. This is a good indication

that the replicon is effectively replicating. The supernatants from

cultures at the different times posttransfection (48 h, 72 h, 96 h and

120 h) were also titrated. As expected, it was not possible to detect

the formation of any viral particle from cell cultures that had been

transfected with the replicon, as opposed to the positive control-

transfected cells which produced infectious virus (Supplementary

Fig. 2).

To be certain that these results were not due to contamina-

tion an immunoﬂuorescence analysis of the replicon in parallel to

the positive and negative controls at 120 h posttransfection using

anti-E (␣-E, 4G2) (Gentry et al., 1982) and anti-NS1 (␣-NS1, 7E11)

(Mason et al., 1990) monoclonal antibodies was also performed. As

expected, the negative control did not react with any of the anti-

bodies, the viral RNA positive control reacted with both antibodies

and the replicon-transfected cells only reacted with the anti-NS1

monoclonal antibody (Supplementary Fig. 3).

To prove that the subgenomic replicon was in fact replicat-

ing RNA was extracted from the transfected cells and subjected

to qPCR using primers from the structural (DENV-3Fow: CCCATC-

CATGACAATGAGATGT and DENV-3Rev: TCAACCCACGTAGCTCCT-

GAT) and non-structural (D3.16: GCCACAGGCTCAGCCTCCTCC

and D3.15: GTCACCATGGGCACCACATCCC) regions. As shown in

Supplementary Fig. 4 there is no sign of replication when the struc-

A.L.P. Mosimann et al. / Journal of Virological Methods 163 (2010) 147–152 151

tural region is evaluated but when using non-structural primers

it is evident the ampliﬁcation of the replicon, although in a much

smaller extent than the positive control.

The possibility that translation was from input RNA appeared

highly unlikely since other researchers have tested this hypothesis

and demonstrated that replication-defective replicons cannot drive

detectable protein synthesis at 48 h posttransfection (Alvarez et al.,

2005a; Jones et al., 2005a; Khromykh and Westaway, 1997). The

increase in the number of positive cells in the replicon transfected

cultures is consistent with the need for viral replication, as the input

RNA cannot produce detectable antigen unless it is ampliﬁed within

the infected cells (Khromykh and Westaway, 1997).

Recently, it has been demonstrated the co-circulation of two dif-

ferent DENV-3 genotypes (III and V) in Brazil (Nogueira et al., 2008).

DENV-3 belonging to genotype III has been associated to the devel-

opment of more severe forms of the disease (Messer et al., 2003;

Silva et al., 2008). We are currently engaged on the biological and

genetic characterization of some DENV-3 clinical isolates obtained

during epidemics in Brazil between 2002 and 2004 (Nogueira et

al., 2008). Preliminary data point to some interesting differences in

the non-structural proteins sequence which were associated with

different viral phenotypes. The next step will be to insert molecular

markers (luciferase or GFP) in the replicon system so that we can

better evaluate the effects of these amino acid substitutions in the

modulation of virus replication.

Acknowledgements

The authors are indebted with Paulo Arauco and Vanessa Stella

for technical help with sequencing and cell cultures procedures,

respectively. Financial support: Fiocruz, CNPq, CNPq/PROSUL,

Fundac¸ ão Araucária. ALPM and LB are supported by fellowships

from CAPES. CNDS is a CNPq fellowship recipient.

Appendix A. Supplementary data

Supplementary data associated with this article can be found, in

the online version, at doi:10.1016/j.jviromet.2009.09.004.

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232

ANEXOS

A. SOLUÇÕES E TAMPÕES

10x TBE: 890 mM Tris-base, 890 mM Ácido bórico, 20 mM EDTA (pH 8.0)

1xPBS: 137 mM NaCl, 2.7mM KCl, 4.3mM Na

HPO

.7H

0, 1.5mM KH

1xPBS/glicerol: 1xPBS, 10% glicerol

Paraformaldeído 3%: solução de paraformaldeído 3% em PBS 1x. Pesar com

mascará e dissolver na capela

SDS 10%: para 1 litro, dissolver 100 g de SDS em água ultrapura e filtrar em 0,45!m

Solução 2.5 mM dNTPs: mistura de 2.5 mM de cada desoxiribonucleotídeos

trifosfatados (dATP, dCTP, dGTP e dTTP, Pharmacia)

Solução CaCl

/Hepes: 100 mM CaCl

, 10 mM HEPES (pH 7.0)

Solução CaCl

/Hepes/glicerol: 100 mM CaCl

, 10 mM HEPES, 10% glicerol estéril

(pH 7.0)

Solução Carboxi Metil Celulose (CMC): 32% de CMC em água MQ, homogenizar

até a dissolver

Solução Clorofórmio/Álcool isoamílico: 24 volumes de clorofórmio, 1 volume de

álcool isoamílico

Solução de sacarose 30%: 30% de sacarose em tampão TNE. Preparar livre

RNase

Solução de sacarose 60%: 60% de sacarose em tampão TNE. Preparar livre de RNase

Solução Fenol/Clorofórmio/Álcool isoamílico: 25 volumes de fenol (pH 7,0,

saturado com 10mM Tris-base) , 24 volumes de clorofórmio, 1 volume de álcool

isoamílico

Solução Triton: 0,5% de triton X100 diluído em 1xPBS

Tampão da Fosfatase Alcalina (AP-BUFFER): 100 mM Tris-HCl pH 9.5 1M, 100

mM NaCl, 5 mM MgCl

Tampão de amostra para DNA 10x: 25% Ficoll (tipo 400), 0.25% azul de

bromofenol, 25% xyleno cianol FF

Tampão STE: 10 mM Tris HCl pH 7.5, 10 mM NaCl 5M, 1 mM EDTA 0.5 M pH 8

Tampão TNE: 50mM tris pH 7.5, 100 mM NaCl, 1mM EDTA

233

B. MEIOS DE CULTURA

Leibovitz’s L-15 Medium completo (Meio de cultura para célula de inseto C

6/36

Meio L-15 comercial (GIBCO) suplementado com 5% de Soro Fetal Bovino (SFB),

Triptose e 25 !g/ml Gentamicina

Meio SOC: 2% Bactotriptona, 0.5 % Extrato de levedura, 10 mM NaCl, 2.5 mM KCl,

10 mM MgCl

, 10 mM MgSO

, 20 mM glicose

Meio líquido TB1x (Meio de cultura “Terrific Broth” para E.coli): 12g/L Caseína

digerida, 24g/L Estrato de levedura, 9.4g/L K

HPO

, 2.2g/L KH

Meio TB/Cloranfenicol: Meio TB1x suplementado com 15 µg/ml de cloranfenicol

Meio LB1x sólido (Meio de cultura “Luria Broth” para E.coli):: 10g/L Bacto-

Triptona, 5g/L Estrato de levedura, 5g/L NaCl, 15g/L ágar

Placas de meio LB sólido/Ampicilina: Meio LB1x sólido suplementado com 100

µg/ml de ampicilina

C. LINHAGENS BACTERIANAS DE Escherichia coli

TOP 10F´ (Invitrogen): F´{lacIq Tn10 (TetR)} mcrA "(mrr-hsdRMS-mcrBC)

#80lacZ"M15 "lacX74 recA1´araD139 "(ara-leu)7697 galU galK rpsL endA1 nupG

TOP10 (Invitrogen): F- mcrA "(mrr-hsdRMS-mcrBC) $80lacZ"M15 "lacX74 recA1

araD139 "(araleu)7697 galU galK rpsL (StrR) endA1 nupG

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