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UNIVERSIDADE CATÓLICA DE PERNAMBUCO
PRÓ-REITORIA ACADÊMICA
COORDENAÇÃO GERAL DE PÓS-GRADUAÇÃO
MESTRADO EM DESENVOLVIMENTO DE PROCESSOS AMBIENTAIS
Micheline Oliveira de Menezes Belo
DEGRADAÇÃO HIDROLÍTICA DOS
CONCENTRADOS OBTIDOS PELO PROCESSO DE
FLOTAÇÃO DE EFLUENTE DA INDÚSTRIA LÁCTEA
Recife
2009
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BELO, M.O.M. Degradação hidrolítica dos concentrados obtidos pelo processo de ...
ii
Micheline Oliveira de Menezes Belo
DEGRADAÇÃO HIDROLÍTICA DOS
CONCENTRADOS OBTIDOS PELO PROCESSO DE
FLOTAÇÃO DE EFLUENTE DA INDÚSTRIA LÁCTEA
Orientadora: Profª. Drª. Christine Lamenha Luna Finkler
Co-orientadora: Profª. Drª. Alexandra Amorim Salgueiro
Recife
2009
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-
Graduação em Desenvolvimento em Processos
A
mbientais da Universidade Católica de
Pernambuco como pré-requisito para obtenção
do título de Mestre em Desenvolvimento de
Processos Ambientais.
Á
rea de Concentração: Desenvolvimento em
Processos Ambientais
Linha de Pesquisa: Informática, Modelagem e
Controle de Processos
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BELO, M.O.M. Degradação hidrolítica dos concentrados obtidos pelo processo de ...
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Belo, Micheline Oliveira de Menezes
Degradação hidrolítica dos concentrados obtidos pelo processo de
flotação de efluente da indústria láctea. Recife, 2008. 68p.
Dissertação (Mestrado) – Universidade Católica de Pernambuco.
Programa de Pós-Graduação em Desenvolvimento de Processos
Ambientais.
1. Hidrólise 2. Indústria láctea 3. Tratamento de efluentes. I.
Programa
de Pós-Graduação em Desenvolvimento de Processos Ambientais.
Centro de Ciências e Tecnologia. Programa de Pós-Graduação em
Desenvolvimento de Processos Ambientais.
BELO, M.O.M. Degradação hidrolítica dos concentrados obtidos pelo processo de ...
iv
MICHELINE OLIVEIRA DE MENEZES BELO
DEGRADAÇÃO HIDROLÍTICA DOS CONCENTRADOS
OBTIDOS PELO PROCESSO DE FLOTAÇÃO DE
EFLUENTE DA INDÚSTRIA LÁCTEA
Dissertação apresentada à Universidade Católica de Pernambuco, como requisito
para a obtenção do título de Mestre em Desenvolvimento de Processos Ambientais.
APROVADA em: 31/03/2009
BANCA EXAMINADORA
____________________________________________
Prof. Dr. Irapuan Oliveira Pinheiro – UPE
Examinador Externo
_____________________________________________
Profª. Drª. Leonie Asfora Saruboo – UNICAP
Examinador Interno
____________________________________________
Profª. Drª. Christine Lamenha Luna Finkler – UNICAP
Orientador
Recife
2009
BELO, M.O.M. Degradação hidrolítica dos concentrados obtidos pelo processo de ...
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Para Juliana, minha filha...
“Vem vindo meu novo ser,
cercado de proteção,
de tanto amor, tanta paz,
dentro do meu coração”
BELO, M.O.M. Degradação hidrolítica dos concentrados obtidos pelo processo de ...
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AGRADECIMENTOS
A Deus pelo dom da vida em comunhão com o Espírito Santo e o amor de seu filho Jesus Cristo. À
Maria, pelo seu amor materno que me protege diariamente com seu manto sagrado.
Ao meu marido, companheiro e amigo DANIEL... meu grande incentivador! A ele a gratidão da
excelente colocação e desempenho ao longo deste curso. Meu muito obrigada pelo apoio constante,
pela insistente cobrança diária ao “tomar minha lição”, e por ser meu esteio perene, pra você: meu
amor eterno...
A minha princesinha Daniela. Minha filhinha linda, presente de Deus pra nós, e principalmente por
sua companhia “visceral”, durante a gestação em que estive longe de casa no intercâmbio com a
UNICAMP, fazendo com que eu não me sentisse sozinha.
Aos meus queridos pais Enoque e Albanisi, meus irmãos: Michel e Júnior e demais familiares, que
junto comigo sonharam e vibraram com cada minuto desta conquista.
Aos meu amados cunhados: Ricardo e Juliana, que me deram total apoio quando estive fora de casa
em minha estada em Campinas/São Paulo e ao meu sogrinho Sr. Belo pelo questionamento e
incentivos tão presentes em nossas conversas e encontros.
A minha mais que orientadora Christine Finkler. Sempre atenta às minhas necessidades, como
também pela sua incomensurável presteza, disponibilidade e dedicação em tudo o que se fez
necessário para a concretização dos objetivos deste trabalho. Aqui Chris, o meu muito obrigada! Você
realmente terá um lugar muito mais que especial na minha vida!
A minha querida co-orientadora Professora Alexandra. Exemplo de paciência e dedicação,
enfrentando sempre um novo desafio em explicar e simplificar o que se parecia inexplicável! Obrigada
pelos sorrisos e pelo tão carinhoso: “Vamos tomar um leitinho”?
Aos queridíssimos professores Valdemir Alexandre e Leonie Asfora pelo carinho e atenção sempre
tão gratuitos e oportunos.
Aos colegas da Terceira Turma. A Andréa Vilar pela companhia, caronas, conversas e principalmente
pela amizade que nasceu de tudo isso! Aos estagiários do NPCIAMB, de forma especial a Caroline
Guirelli e Elma Lareste alunas de PIBIC, as doutorandas Raquel, Juliana e Adriana, e aos técnicos e
demais professores, com os quais tive o prazer de conviver e aprender durante esses preciosos dois
anos de curso.
A CAPES-PROSUP pela concessão da bolsa durante o curso.
BELO, M.O.M. Degradação hidrolítica dos concentrados obtidos pelo processo de ...
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SUMÁRIO
AGRADECIMENTOS
vi
SUMÁRIO
vii
LISTA DE FIGURAS
ix
LISTA DE TABELAS
xi
LISTA DE SÍMBOLOS
xii
LISTA DE ABREVIATURAS
xiii
RESUMO
1
ABSTRACT
3
CAPÍTULO 1
5
1.1 Introdução
5
1.2 Revisão da Literatura
7
1.2.1. Efluentes lácteos e as fiscalizações quanto ao seu descarte em
corpos d’água
7
1.2.2. A indústria de laticínios no Brasil
9
1.2.3. Efluente lácteo
11
1.2.4. Tipos de tratamento aplicados a efluentes lácteos
12
1.2.4.1. Flotação
13
1.2.4.2. Tratamento biológico
15
1.2.4.3. Tratamento enzimático e uso de lipases
16
1.2.4.4. Mercado de enzimas industriais
20
1.3 Objetivos
22
1.3.1 Objetivo Geral
22
1.3.2 Objetivos Específicos
22
1.4 Referências
23
CAPÍTULO 2
Caracterizações microbiológica e físico-química de efluente lácteo
visando à obtenção de consórcio microbiano
29
Resumo
30
BELO, M.O.M. Degradação hidrolítica dos concentrados obtidos pelo processo de ...
iii
Abstract
31
2.1 Introdução
32
2.2. Materiais e Métodos
33
2.2.1. Coleta e acondicionamento do efluente
33
2.2.2. Caracterização microbiológica
33
2.2.3. Caracterização físico-química
34
2.2.4. Obtenção do consórcio microbiano
34
2.2.5. Avaliação qualitativa da atividade enzimática
35
2.2.6. Atividade lipásica
36
2.3. Resultados e Discussão
36
2.4. Conclusões
41
2.5. Referências
41
CAPÍTULO 3
Degradação hidrolítica de material flotado de efluente lácteo
industrial
44
Resumo
45
Abstract
46
3.1 Introdução
47
3.2 Material e Métodos
48
3.2.1. Coleta e acondicionamento do efluente
48
3.2.2. Ensaios de Flotação
48
3.2.3. Obtenção do consórcio microbiano
49
3.2.4. Tratamento enzimático do flotado
49
3.2.5. Determinações analíticas
50
3.3 Resultados e Discussão
53
3.4 Conclusões
67
3.5 Referências
67
BELO, M.O.M. Degradação hidrolítica dos concentrados obtidos pelo processo de ...
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x
LISTA DE FIGURAS
Figura 1.1 – Representação esquemática de uma coluna de flotação 14
Figura 1.2 – Hidrólise seqüencial dos grupos acila no glicerídeo catalisada por
lipases
18
Figura 2.1 - Biorreator contendo efluente lácteo para obtenção do consórcio
microbiano
35
Figura 2.2 - Resultados de contagem de bactérias heterotróficas durante cultivo do
efluente lácteo em biorreator (200rpm, 1vvm, 28-30
o
C)
37
Figura 2.3 - Resultados de contagem de fungos e leveduras durante cultivo do
efluente lácteo em biorreator (200rpm, 1vvm, 28-30
o
C)
37
Figura 2.4 - Demanda Química de Oxigênio (DQO) durante o cultivo do efluente
lácteo em biorreator (250 rpm, 1vvm, 30ºC)
39
Figura 2.5 – Resultados de atividade lipásica durante cultivo do efluente lácteo em
biorreator (250rpm, 1vvm, 30ºC)
40
Figura 3.1 – Reação de transesterificação de triglicerídeos
51
Figura 3.2 – Cromatograma típico da análise de ácidos graxos (Condições: coluna
capilar de sílica fundida de dimensões 30m x 0,25mm x 1µm, temperatura do
detector de 250
o
C; temperatura do vaporizador de 200
o
C; programação do formo:
50
o
C por 5min; 5
o
C/min até 110
o
C, permanecendo por 4 minutos, e 4
o
C/min até
150
o
C, permanecendo por 5 minutos)
54
Figura 3.3 – Superfície de resposta (A) e curva de contorno (B) para o percentual
de liberação de ácidos graxos como função da concentração de enzima e da
agitação (tempo de hidrólise de 4 horas; 95% de significância; teor inicial de ácidos
graxos de 13,36g/L)
56
Figura 3.4 – Diagrama de Pareto (A) e valores preditos versus valores observados
(B) para o percentual de liberação de ácidos graxos como função da concentração
de enzima e da agitação (tempo de hidrólise de 4 horas; 95% de significância; teor
inicial de ácidos graxos de 13,36g/L)
57
Figura 3.5 – Superfície de resposta (A) e curva de contorno (B) para o pH como
função da concentração de enzima e da agitação (tempo de hidrólise de 4 horas;
95% de significância)
58
BELO, M.O.M. Degradação hidrolítica dos concentrados obtidos pelo processo de ...
x
Figura 3.6 – Diagrama de Pareto (A) e valores preditos versus valores observados
(B) para o pH como função da concentração de enzima e da agitação (tempo de
hidrólise de 4 horas; 95% de significância)
59
Figura 3.7 – Superfície de resposta (A) e curva de contorno (B) para a atividade
lipásica como função da concentração de enzima e da agitação (tempo de hidrólise
de 4 horas; 95% de significância)
60
Figura 3.8 – Diagrama de Pareto (A) e valores preditos versus valores observados
(B) para a atividade lipásica como função da concentração de enzima e da agitação
(tempo de hidrólise de 4 horas; 95% de significância)
61
Figura 3.9 – Fotos do experimento de hidrólise. (A) antes da hidrólise e (B) após
48h de hidrólise
63
Figura 3.10 – Superfície de resposta (A) e curva de contorno (B) para o percentual
de liberação de ácidos graxos como função da concentração de enzima e da
concentração de consórcio (tempo de hidrólise de 4 horas; 95% de significância;
teor inicial de ácidos graxos de 13,36g/L)
64
Figura 3.11 – Diagrama de Pareto (A) e valores preditos versus valores observados
(B) para o percentual de liberação de ácidos graxos como função da concentração
de enzima e da concentração de consórcio (tempo de hidrólise de 4 horas; 95% de
significância; teor inicial de ácidos graxos de 13,36g/L)
65
BELO, M.O.M. Degradação hidrolítica dos concentrados obtidos pelo processo de ...
xi
LISTA DE TABELAS
Tabela 1.1 – Fontes de lipídios e suas concentrações em águas residuárias 8
Tabela 2.1 - Caracterização físico-química do soro de queijo 38
Tabela 2.2 - Resultados de atividades enzimáticas das amostras do consórcio
microbiano obtido a partir do cultivo em soro de queijo
40
Tabela 3.1 – Primeiro planejamento experimental utilizado nos ensaios de hidrólise 49
Tabela 3.2 – Segundo planejamento experimental utilizado nos ensaios de hidrólise 50
Tabela 3.3 – Concentrações dos ácidos graxos presentes no material flotado 53
Tabela 3.4 - Parâmetros da análise de variância para o percentual de liberação de
ácidos graxos, pH e atividade lipásica no primeiro planejamento experimental para
um tempo de hidrólise de 4 horas.
62
Tabela 3.5 - Parâmetros da análise de variância para o percentual de liberação de
ácidos graxos no segundo planejamento experimental para um tempo de hidrólise
de 4 horas.
66
BELO, M.O.M. Degradação hidrolítica dos concentrados obtidos pelo processo de ...
xii
LISTA DE SÍMBOLOS
v/v
volume por volume
vvm
volume de ar por volume de meio por minuto
rpm rotações por minuto
kDa
quilodalton
f
fator utilizado para o cálculo das concentrações dos ácidos graxos
C
concentração conhecida de uma amostra-padrão (g/L)
A
área do cromatograma
AGL
ácidos graxos livres
AGF
ácidos graxos do flotado (g/L)
AGT
ácidos graxos dos triglicerídeos (não hidrolisados) (g/L)
BELO, M.O.M. Degradação hidrolítica dos concentrados obtidos pelo processo de ...
xiii
LISTA DE ABREVIATURAS
DQO Demanda Química de Oxigênio
UFC Unidade Formadora de Colônia
pH Potencial hidrogeniônico
CONAMA Conselho Nacional do Meio Ambiente
ANA Agência Nacional de Águas
SEBRAE Serviço Brasileiro de Apoio às Micro e Pequenas Empresas
SISNAMA Sistema Nacional do Meio Ambiente
IBGE Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística
E C Enzyme Comission
NPCIAMB
Núcleo de Pesquisas em Ciências Ambientais
APHA American Public Health Association
UASB Upflow Anaerobic Sludge Blanket
DBO Demanda Bioquímica de Oxigênio
CP Contagem padrão
pNPP Paranitrofenilpalmitato
UI Unidade Internacional
AN Agar Nutritivo
BELO, M.O.M. Degradação hidrolítica dos concentrados obtidos pelo processo de ...
1
RESUMO
A primeira etapa do presente trabalho consistiu em caracterizar um efluente lácteo
industrial (soro de queijo) em termos microbiológicos e físico-químicos visando à obtenção de um
consórcio de microrganismos para a sua biodegradação. Foram determinadas a contagem
padrão de bactérias heterotróficas e a contagem de fungos filamentosos e leveduras de acordo
com as metodologias oficiais, e a caracterização físico-química foi realizada em termos do teor de
proteínas, cinzas, lipídios, carboidratos, pH e demanda química de oxigênio (DQO). O consórcio
microbiano foi obtido em biorreator operando em batelada e contendo 1,5L do efluente, a 200rpm,
aeração de 1vvm e temperatura de 28 - 30
o
C. Os cultivos foram realizados em duplicata durante
onze dias, sendo realizado um pulso de 150mL do efluente (10% do volume útil do biorreator) no
sétimo dia do cultivo. Foram obtidas concentrações iniciais de 3x10
9
UFC/mL e 8x10
4
UFC/mL
para contagem total de bactérias e de fungos e leveduras, respectivamente. O efluente
apresentou uma DQO inicial de 64.000mgO
2
/L, pH 5,0, e concentrações correspondentes a
5g/100mL de carboidratos, 0,8g/100 mL de proteínas e 0,6g/100 mL de lipídios. Os cultivos do
efluente no biorreator demonstraram um aumento da concentração de bactérias ao longo do
tempo, atingindo 1x10
13
UFC/mL após oito dias, enquanto que as concentrações de fungos
filamentosos e de leveduras foram inibidas. Foi observada uma redução da DQO de 47 a 63,5%
após 11 dias de cultivo, demonstrando a potencialidade da utilização do consórcio microbiano no
tratamento do efluente. Ensaios qualitativos demonstraram a presença das enzimas: lipase,
amilase, protease e celulase no extrato metabólito do consórcio microbiano. No entanto, foram
obtidos baixos valores de atividade lipolítica quando comparados com a atividade da enzima
comercial, sendo observado ainda que a atividade decresce ao longo do tempo.
Na segunda etapa do trabalho foi avaliada a hidrólise enzimática de material flotado,
obtido a partir do processo de flotação em coluna do efluente, utilizando a técnica de
planejamento de experimentos. Inicialmente, foi avaliado o desempenho de uma lipase comercial
(lipolase®), sendo investigados os efeitos da agitação e da concentração de enzima sobre a
hidrólise. Foi realizada a análise estatística considerando os efeitos significativos para um nível
de confiança de 95%. Concentrações maiores de enzima dentro da faixa investigada (1 a 7%)
maximizam a hidrólise de óleos e gorduras do material flotado, bem como para níveis de agitação
entre 100 e 150rpm. Em todos os experimentos houve a liberação de ácidos graxos no meio em
percentuais próximos a 100% apenas após 4 horas de reação. Vale salientar ainda que
percentuais de liberação de ácidos graxos superiores a 92% foram obtidos para toda a faixa de
concentração testada. Uma agitação de 150rpm foi utilizada em um segundo planejamento
experimental, avaliando-se a concentração da enzima comercial associada a um consórcio
BELO, M.O.M. Degradação hidrolítica dos concentrados obtidos pelo processo de ...
2
microbiano, sendo verificado que a adição do consórcio não influenciou de maneira positiva o
aumento do teor de ácidos graxos livres no meio.
Palavras-Chave: hidrólise, indústria láctea, tratamento de efluente, lipase, flotado.
BELO, M.O.M. Degradação hidrolítica dos concentrados obtidos pelo processo de ...
3
ABSTRACT
The first step of the present work was characterizing a dairy effluent in terms
microbiological and physical-chemical used to obtain a microbial consortium for its biodegradation.
Microbiological characterization was performed by total heterotrophic bacteria, filamentous fungi
and yeasts count according to the official methodologies. Physical-chemical characterization was
accomplished by content of protein, ash, lipids, carbohydrates, pH and chemical oxygen demand
(COD). Microbial consortium was obtained in batch using a bioreactor containing 1,5L of dairy
effluent, at 200 rpm, 1vvm, at 28 - 30
o
C. Cultivations were performed in duplicate for eleven days,
being applied a pulse of 10% (v/v) of effluent on the seventh day of the experiment. Cellular
growth kinetics, chemical oxygen demand concentration and lipolytic activity were determined.
Initial concentrations of bacteria and fungi and yeasts were equal to 3x10
9
CFU/mL and
8x10
4
CFU/mL, respectively. Effluent presented a COD of 64.000mgO
2
/L, pH 5,0 and
concentrations of 5g/100mL of carbohydrates, 0,8g/100mL of protein and 0,6g/100mL of lipids.
Cultivations showed an increase on the bacteria concentration, reaching 1x10
13
CFU/mL after eight
days, while filamentous fungi and yeast concentrations were inhibited. An reduction of COD
concentration in the range of 47 to 63,5% was observed after eleven days of cultivation,
demonstrating the potentiality of use of microbial consortium for effluent treatment. Qualitative
assays showed the presence of the enzymes lipase, amylase, protease and cellulase in the
metabolic extract of the microbial consortium. However, low values of lipolytic activity were
obtained as compared to the commercial enzyme, being observed that activity decreases along
time.
In the second step of this study, was evaluated the enzymatic hydrolysis of floated
material, obtained from the column flotation of a dairy industry, using the technique of
experimental design. Initially, performance was evaluated by a commercial lipase (lipolase®),
being investigated the effects of agitation and enzyme concentration on hydrolysis. A statistical
analysis was performed considering the significance of effects to a confidence level of 95%.
Higher enzyme concentrations in the range investigated (1 to 7%) maximize the hydrolysis of oils
and fats in the floated material, and to agitation levels between 100 and 150rpm. In all
experiments, fatty acids were released in rates near to 100% only after 4 hours of reaction.
Moreover, rates of released fatty acids were greater than 92% in all the concentration range
tested. An agitation of 150rpm was used in a second experimental design, evaluating the
concentration of commercial enzyme associated with a microbial consortium. The kinetic
monitoring of the process showed that the addition of the consortium did not influence in a positive
manner the increase the content of free fatty acids.
BELO, M.O.M. Degradação hidrolítica dos concentrados obtidos pelo processo de ...
4
Keywords: hydrolysis, dairy industry, effluent treatment, lipase.
BELO, M.O.M. Degradação hidrolítica dos concentrados obtidos pelo processo de ...
5
CAPÍTULO 1
1.1 Introdução
As agressões ao meio ambiente têm representado uma grande preocupação no mundo
inteiro, pois os processos tecnológicos e industriais estão intimamente ligados a uma maior
emissão de poluentes. Apenas nos últimos anos a preocupação com estes danos e suas
conseqüências tem se tornado mais pungente e, desta forma, surgiu a necessidade premente da
utilização racional dos recursos naturais não renováveis. Com isso, a preocupação com a água,
que é um dos recursos mais preciosos, deve ser constante, uma vez que suas fontes são finitas e
o despejo de efluentes industriais sem tratamento prévio nestes corpos hídricos é preocupante.
O ideal seria que todas as empresas inseridas no mercado oferecessem produtos de
qualidade a partir de tecnologias limpas, sem causar danos ao meio ambiente. Contudo, muitas
dessas empresas, principalmente as de pequeno e de médio porte, não têm como se adequar a
esta realidade pelos altos custos gerados com a implementação das normas adequadas de
tratamento e de descarte de efluentes preconizadas pelas entidades responsáveis pela
elaboração e fiscalização destas leis (SEBRAE,1997).
Nos últimos cinco anos, pesquisas recentes têm apontado o nosso país como um
potencial exportador de leite e de seus derivados. De maneira concomitante, foi verificado que o
consumo interno pela população em busca destes produtos também teve um aumento
considerável. Impulsionado por esses dois grandes motivos, a indústria leiteira está em ascensão
e, com isso, um problema: a quantidade de efluentes lácteos gerados, que na maioria das vezes
não passam por nenhum tipo de tratamento, causando sérios problemas ambientais,
principalmente quando lançados em corpos hídricos.
As características dos efluentes lácteos são dependentes da natureza do processo
industrial e do tipo de produto que é gerado, exigindo formas específicas de tratamento. No
entanto, destaca-se nesses efluentes a elevada carga orgânica, representada principalmente
pelas proteínas e gorduras. Em geral, são empregados inicialmente os tratamentos primários
convencionais, tais como a sedimentação, filtração e flotação, que permitem a remoção parcial
BELO, M.O.M. Degradação hidrolítica dos concentrados obtidos pelo processo de ...
6
dos sólidos em suspensão. Estes tratamentos podem ser aperfeiçoados pela utilização de
substâncias químicas coagulantes, como polímeros e sais de ferro e alumínio, que promovem a
coagulação do material presente no efluente. Nas fases subseqüentes podem ser utilizados os
tratamentos secundário, terciário e quaternário, dependendo da característica desejada do
efluente tratado.
No que concerne às formas de tratamentos biológicos, a utilização do lodo ativado nas
indústrias de laticínios apresenta uma série de vantagens: as bactérias anaeróbias presentes no
processo são menos susceptíveis à inibição por diversas substâncias químicas; o curto tempo de
adaptação do lodo ao resíduo de interesse; a não necessidade de pós-tratamento; a menor
possibilidade de geração de efluente com aspecto desagradável; a grande flexibilidade de
operação; a elevada eficiência de tratamento e o porte relativamente pequeno das unidades
(VON SPERLING, 1997).
A utilização de um pré-tratamento enzimático vem sendo proposta como uma alternativa
para diversos tipos de resíduos, sendo o uso de lipases em efluentes de laticínios atualmente
empregado com sucesso. Embora, a aplicação de enzimas comerciais muitas vezes inviabiliza o
processo de tratamento em função dos altos custos apresentados. O emprego de consórcio
microbiano produtor de enzimas hidrolíticas, associado ou não a enzimas comerciais, constitui-se
uma alternativa mais econômica para o pré-tratamento destes resíduos.
Considerando a importância econômica e social das indústrias de laticínios em nosso
Estado e buscando viabilizar medidas que minimizem o impacto ambiental causado por estes
rejeitos líquidos, este trabalho se propõe a investigar a degradação hidrolítica de efluentes
concentrados da indústria láctea, obtidos pelo processo de flotação, através da utilização de
lipases e/ou consórcios microbianos produtores de enzimas.
BELO, M.O.M. Degradação hidrolítica dos concentrados obtidos pelo processo de ...
7
1.2 Revisão da Literatura
1.2.1. Efluentes lácteos e as fiscalizações quanto ao seu descarte em corpos d’água
Nos últimos anos é crescente a preocupação das empresas em reduzir o impacto
ambiental decorrente de seus processos industriais. Além disso, a população passou a perceber
que a preservação dos recursos ambientais está diretamente ligada à qualidade de vida. Os
governos implantaram uma legislação mais rigorosa e uma fiscalização mais atuante para punir
de forma mais rígida os crimes cometidos contra o meio ambiente. Desta forma, as grandes
corporações perceberam que são as maiores responsáveis pela gestão ambiental, passando a
considerar o assunto primordial tanto para se adequarem a fiscalização ambiental quanto para
captar um maior número de consumidores preocupados com a consciência ambiental das
empresas que produzem bens do seu interesse.
Nosso país, dentro do contexto mundial, é uma boa representação de um território em
ascensão. O seu crescimento populacional aliado ao eminente desenvolvimento tecnológico e
industrial faz com que cada vez mais se busquem na natureza recursos que viabilizem a
fabricação de novos equipamentos, moradia e matéria-prima para os mais diversos fins, fazendo
com que haja gradativamente o desaparecimento de alguns recursos naturais e a escassez de
outros, como é o caso da água.
Todo esse crescimento tem um preço, e o planeta tem respondido de maneira veemente
que não consegue buscar o equilíbrio na mesma velocidade em que é constantemente agredido,
principalmente no que concerne aos rejeitos industriais que são descartados em superfícies
aqüíferas ou próximas aos lençóis d’água. Com isso, os órgãos de controle ambiental têm
introduzido medidas que visam à valorização da água como bem de consumo. É o caso da
Política Nacional de Recursos Hídricos, implementada pela Lei 9.984 de 17 de julho de 2000, que
trata dos aspectos gerais atinentes à utilização dos corpos de água como bem público, e da
criação da Agência Nacional de Águas (ANA), uma entidade federal vinculada ao Ministério do
Meio Ambiente que tem por finalidade supervisionar, controlar e avaliar as ações e atividades
decorrentes do cumprimento da legislação federal pertinente aos recursos hídricos (BRASIL,
2000).
Além disso, o CONAMA (Conselho Nacional do Meio Ambiente), órgão consultivo e
deliberativo do Sistema Nacional do Meio Ambiente – SISNAMA, criou uma legislação que
BELO, M.O.M. Degradação hidrolítica dos concentrados obtidos pelo processo de ...
8
classifica os corpos de água e estabelece as condições e padrões de lançamento de efluentes
sob o número 357 de 17 de abril de 2005 (CONAMA, 2005). O conjunto dessas ações é mais
uma ferramenta para se reduzir o impacto ambiental, criando assim um movimento progressivo
de conscientização da população para uma utilização racional destes recursos.
Dentre as diversas pesquisas que visam à redução do impacto ambiental causado pelo
descarte de efluentes industriais, um dos principais desafios encontrados é o tratamento de
efluentes contendo elevados teores de lipídios.
Os lipídios, juntamente com proteínas e carboidratos, compõem os principais compostos
orgânicos de águas residuárias de diversas indústrias de alimentos (RAUNKJAER, HVITEVED-
JACOBSEN, NIELSEN, 1994) e até mesmo da indústria de ração animal, sendo esta uma das
maiores produtoras de efluentes ricos em óleos e gorduras (JEGANATHAN, BASSI, NAKHA,
2006). Esses compostos causam grandes danos ao meio ambiente, como a formação de filmes
oleosos nas superfícies aquáticas que dificultam a dispersão de luz e conseqüente difusão de
oxigênio para o meio, causando danos à biota local (MONGKOLTHANARUK e DHARMISTHITI,
2002). As principais fontes de geração de lipídios são indústrias de óleos comestíveis, sorvetes,
laticínios, curtumes, matadouros e os efluentes domésticos e de restaurantes, como pode ser
observado na Tabela 1.1.
Tabela 1.1 – Fontes de lipídios e suas concentrações em águas residuárias
Tipos de efluentes Concentração de
lipídios (mg/L)
Referência
Doméstico 40-100 HENZE (1992)
Matadouros e avícolas Acima de 500 PETRUY e LETTINGA (1997)
Laticínios 4.680 MENDES et al. (2004)
Restaurantes 98 DHARMISTHITI e KUHASUNTISOOK
(1998)
Azeite de oliva 16.000 De FELICE et.al. (1997)
Sorvetes 845 HAWKES et al. (1995)
Os critérios de seleção de um efluente a ser lançado em um curso d’água obedecem a
exigências da Legislação Ambiental da Lei Federal número 6.938 de 31 de agosto de 1981
(SÍLEX, 1981), onde são estabelecidos padrões de tratamento como primário, secundário,
terciário e quaternário, recomendados de acordo com a natureza do efluente a ser tratado.
As políticas governamentais que limitam a entrada de uma indústria no setor de laticínios
estão assumindo importância crescente e tendem a se tornar fatores limitantes também para as
BELO, M.O.M. Degradação hidrolítica dos concentrados obtidos pelo processo de ...
9
empresas já instaladas. As duas principais barreiras decorrentes de políticas públicas neste setor
referem-se à legislação ambiental e às limitações para comercialização de produtos em função
de registros. Segundos essas exigências, os novos laticínios que quiserem instalar-se legalmente
terão que se adequar à legislação ambiental e às exigências dos órgãos de fiscalização
competentes. Em ambos os casos, os recursos exigidos para entrada de novas empresas no
mercado, principalmente em se tratando de laticínios de pequeno porte, implicarão em
investimentos substancialmente maiores em relação aos aplicados até então aos laticínios já
instalados (SEBRAE/MG, 1997). Este fato assume maior importância quando se percebe que
uma pequena parte dos laticínios instalados possui algum sistema de tratamento de efluentes e
que a maioria deles não tem condição de se adequar de maneira imediata à legislação ambiental
vigente.
1.2.2. A indústria de laticínios no Brasil e em Pernambuco
Grande parte do território nacional possui este tipo de indústria, que é responsável por
uma parcela importante de nossa economia, tanto na geração de empregos quanto na oferta de
produtos. A produção brasileira de leite cresceu na década de 90 a uma taxa média de 4,29% ao
ano. A produção informal de produtos lácteos brasileiros cresceu 50% enquanto que a formal
cresceu apenas 16% na década de 90, o que aumentou ainda mais o volume de efluentes
gerados e descartados sem qualquer tratamento (SCALCO E TOLEDO, 2003). A produção de
leite no país vem aumentando desde 2000, e atualmente ocupa a sexta colocação no ranking dos
exportadores. Os produtos lácteos brasileiros são enviados para mais de 70 países, o que
movimenta cerca de 200 milhões de reais por ano (SEBRAE AGRONEGÓCIOS, 2007). O
território nacional reúne mais de um milhão de produtores, gerando 3,6 milhões de postos
permanentes de trabalho.
Em 2002, a produção nacional de leite era em torno de 21 bilhões de litros por ano,
gerando cerca de 84 bilhões de litros de efluentes, após as etapas de produção e beneficiamento,
sendo que mais de 90% deste montante não recebia nenhum tipo de tratamento (SEBRAE/MG,
1997, 1998 e 2002).
Segundo o SEBRAE (1997), a maioria dos estabelecimentos produtores de leite e
derivados são de pequeno porte, de origem familiar ou artesanal, e, concomitante a isso, na
maioria das vezes sem registro no Serviço de Inspeção Federal. Devido a esta realidade
econômica, o tratamento destes efluentes é dificultado, havendo a cobrança por providências por
parte dos órgãos de fiscalização. No entanto, as alternativas de tratamento disponíveis
apresentam problemas de custo e necessidade permanente de manutenção para superação de
BELO, M.O.M. Degradação hidrolítica dos concentrados obtidos pelo processo de ...
10
problemas tecnológicos inerentes aos processos, o que só vem a corroborar com o não
cumprimento das normas e deveres adequados para produção e descarte de rejeitos (ROSA,
2004).
A indústria de laticínios está presente, em maior ou menor escala, em todos os Estados
brasileiros. A maior concentração se verifica nos estados onde a produção de leite e o consumo
de laticínios são mais desenvolvidos. Assim sendo, Minas Gerais possuía em 2001, 34,16% dos
estabelecimentos; São Paulo - 13,93%; Goiás - 10,16%; Paraná - 8,03%; Rio Grande do Sul -
5,95% e Rio de Janeiro - 3,52% (INDI, 2001).
Em Pernambuco, as produções de leite e seus derivados constituem um dos principais
suportes econômicos nas microrregiões Vale do Ipojuca, Vale do Ipanema e Garanhuns, além de
manter uma importância relativa nos pólos de produção de leite e lácteos estabelecidos na Zona
da Mata, Sertão do São Francisco, Sertão do Araripe e Sertão do Pajeú. É uma atividade
econômica de grande importância e em crescimento. De acordo com o Instituto Brasileiro de
Geografia e Estatística (IBGE), a produção subiu de 266,1 milhões de litros anuais, em 1999,
para 360,2 milhões em 2001, sendo a cidade de Garanhuns responsável por 80% da produção
(SEBRAE, 2007).
A atração de investimentos e o desenvolvimento das cidades do interior de Pernambuco
vêm se intensificando ao longo dos anos, e uma das prioridades é o desenvolvimento da indústria
láctea no Estado. De acordo com uma notícia publicada em 07/03/07, a empresa Parmalat do
Brasil S.A.
investiu R$ 12 milhões na modernização da fábrica localizada em Garanhuns, sendo
R$ 10 milhões utilizados em novas tecnologias e maquinário para a produção de leite e outros R$
2 milhões para a recuperação do núcleo de produção de iogurte, também em Garanhuns.
Atualmente, Pernambuco é responsável por 1,8% da produção nacional de leite comercializado
por esta empresa (PERNAMBUCO, 2007).
Investimentos do Governo incluem ainda o incentivo aos pequenos produtores de leite.
Dados de 2005 revelam que a agropecuária pernambucana, onde está incluída a pecuária
leiteira, representa 8% na economia estadual sendo em torno de 14 mil pequenos e médios
produtores de leite em Pernambuco. O Estado possui aproximadamente 17 indústrias de
derivados do leite, onde 10 estão localizadas na Região Metropolitana do Recife, que
compreende os municípios de Recife, Olinda e Jaboatão dos Guararapes, e as restantes
encontram-se espalhadas pelos outros municípios do Estado (PRODUÇÃO RURAL, 2005).
Todo esse crescimento, aliado às perspectivas de melhoria das questões ambientais
ocasionada por uma legislação mais rígida sobre o controle de dejetos e a poluição de
mananciais, indica que é possível vislumbrar que no ano de 2020 o Brasil faça parte de um
BELO, M.O.M. Degradação hidrolítica dos concentrados obtidos pelo processo de ...
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cenário perfeito para o aumento da produção leiteira, além de uma ampliação do quadro de
exportação tanto do leite quanto dos produtos lácteos (SEBRAE AGRONEGÓCIOS, 2007).
1.2.3. Efluente lácteo
As indústrias de alimentos, nas quais estão inseridos os laticínios, utilizam grande
quantidade de água no processo industrial, gerando águas residuárias. Estes rejeitos
caracterizam-se pela elevada carga orgânica em termos de lipídios, proteínas, carboidratos e
concentração de sólidos em suspensão, variando sua composição de acordo com o
processamento adotado pelas empresas e a presença dos diferentes ácidos graxos de cadeia
longa (MENDES, PEREIRA, CASTRO, 2006).
As indústrias de laticínios geram milhares de metros cúbicos de efluentes por dia, os quais
causam sérios problemas às estações de tratamento e, de forma paralela, ao meio ambiente. Os
efluentes são caracterizados pela elevada concentração de matéria orgânica, maior que a
encontrada em esgotos domésticos, sendo esta originada pela presença de lactose, gorduras e
proteínas oriundas do leite (PERLE, KIMCHIE, SHELEF, 1995). Segundo Carta et al. (1999), o
tratamento desses efluentes é fundamental para enquadrá-los abaixo dos padrões de descarte
vigentes devido ao seu grande impacto ambiental.
Se a planta industrial produzir insumos mais elaborados (queijo, requeijão e iogurte), os
efluentes líquidos podem conter açúcar, pedaços de fruta, essências, condimentos e subprodutos
como soro e leitelho (SEBRAE/MG, 1998).
O soro, o leitelho e o leite ácido são resíduos líquidos que não devem ser misturados aos
demais efluentes da indústria, devido a sua elevada composição orgânica e seu grande valor
nutritivo, com potencial de uso na fabricação de outros produtos lácteos ou na alimentação de
animais (LEAL, 2000). Contudo, esta não é uma preocupação real que ocorra em pequenos
laticínios. Juntamente ao efluente gerado neste tipo de indústria ainda há a presença do esgoto
sanitário e o acúmulo das águas de refrigeração e das caldeiras.
Segundo Vidal (2000), os efluentes das indústrias de laticínios são geralmente produzidos
de forma intermitente, e seu fluxo e características variam de uma indústria para outra
dependendo dos tipos de sistemas e métodos de operação. Além disso, podem ocorrer elevadas
flutuações diárias, associadas aos processos de limpeza e ao final dos ciclos produtivos.
Aparentemente, os maiores contribuintes para o elevado volume de efluentes gerados são os
processos de limpeza dos tanques de armazenamento. Porém há outras fontes geradoras de
efluentes que são associadas ao mau funcionamento dos equipamentos e aos erros operacionais
e que certamente geram rejeitos de composição indesejada e prejudiciais ao meio ambiente
BELO, M.O.M. Degradação hidrolítica dos concentrados obtidos pelo processo de ...
12
(DANALEWICH, PAPAGIANNIS, BELYEA, 1998). Os fatores que determinam a carga poluidora e
o volume dos efluentes líquidos gerados são os processos industriais em curso, o volume de leite
processado, as condições e os tipos de equipamentos utilizados, as práticas de redução da carga
poluidora e do volume de efluentes, o gerenciamento e a postura da indústria quanto às práticas
de gestão ambiental e a quantidade de água na limpeza e no sistema de refrigeração
(MARSHALL e HARPER, 1984).
Os efluentes lácteos contêm predominantemente leite e produtos do leite que são
perdidos nos processos. A perda de leite para o efluente pode atingir de 0,5% a 2,5% do leite que
entra para ser processado, podendo chegar até 3-4% deste produto. No entanto, todos os
compostos são biodegradáveis, e alguns deles, como a lactose, são prontamente consumidos no
tratamento biológico, enquanto as proteínas e gorduras são mais dificilmente degradadas (OMIL,
GARRIDO, ARROJO, 2003).
Estudos realizados mostram a composição dos ácidos graxos derivados de triacilgliceróis
provenientes da gordura e que se encontram presentes no efluente. Os componentes majoritários
encontrados foram os ácidos palmítico (16 carbonos – 23,5% do total de ácidos), oléico (18
carbonos com 1 insaturação – 21,0% do total de ácidos), mirístico (14 carbonos – 10,5% do total
de ácidos) e esteárico (18 carbonos – 10,0% do total de ácidos) (MULDER e WALSTRA, 1974)
apud (PETRUY e LETTINGA, 1997). A presença de óleos e graxas em águas residuárias causa
sérios problemas ambientais, pois estas substâncias podem formar filmes oleosos na superfície
de corpos receptores, impedindo a difusão do oxigênio para a água e prejudicando o sistema
local (MONGKOLTHANARUK e DHARMSTHITI, 2002).
Outros componentes de efluentes de laticínios que geram problemas são os detergentes e
sanitizantes utilizados na limpeza da indústria. Os compostos mais utilizados são os limpadores
alcalinos (Na
2
CO
3
e NaOH), polifosfatos e agentes molhantes (alquil aril sulfonados e
surfactantes de amônio quaternário). Estes são usados em pequenas quantidades, entretanto,
são os que mais contribuem para a carga de DBO dos detergentes. Além de sua capacidade
detergente, os sais de amônio quaternário também possuem atividade germicida e anti-séptica.
Estes compostos podem contribuir para o aumento das concentrações de bases, fosfatos e
ácidos, além de serem tóxicos e colaborarem para a baixa performance do tratamento de
efluentes na indústrias de laticínios (DANALEWICH, 1998).
1.2.4. Tipos de tratamento aplicados a efluentes lácteos
Os principais impactos ambientais ocasionados pelas indústrias de laticínios estão
relacionados ao lançamento dos efluentes líquidos, incluindo águas de lavagem de equipamentos
BELO, M.O.M. Degradação hidrolítica dos concentrados obtidos pelo processo de ...
13
e piso, como também a geração de resíduos sólidos e emissões atmosféricas, geralmente sem
nenhum controle ou tratamento. Os resíduos sólidos incluem embalagens e bombonas plásticas,
embalagens de papelão, lixo doméstico, cinzas de caldeiras, e em menor quantidade, metais e
vidros que podem significar perdas econômicas e agressões ao meio ambiente. Em geral, são
utilizadas as grades simples como tratamento primário para remoção de sólidos grosseiros e
desarenadores para remoção da areia proveniente das operações de lavagem na plataforma de
recepção (MACHADO, SILVA, FREIRE, 2001). As gorduras em estado livre são retiradas através
de caixas comuns de gorduras e, quando há formação de emulsão, esta deve ser quebrada pela
adição de produtos químicos e utilização de flotação por ar dissolvido de modo contínuo
(COUTO, MELO, MASSARANI, 2002).
No tratamento primário, é removido o material sólido em suspensão e/ou flutuante ou
ainda é realizado o ajuste do pH para posterior tratamento. As principais técnicas utilizadas no
tratamento primário são: Gradeamento, Sedimentação, Equalização, Neutralização (correção do
pH) e Flotação. O processo de tratamento varia de acordo com a natureza do efluente e, no caso
de efluentes de laticínios, além do tratamento convencional, são utilizados outros tipos de
recursos físico-químicos que permitem a remoção parcial da matéria orgânica representada pelas
proteínas e gorduras, através da precipitação destes compostos com substâncias químicas
(coagulação-floculação) (RUSTEN, LUNDAR, EIDE, 1993). Entretanto, o uso destes reagentes
possui altos custos e muitas vezes a remoção de DQO é baixa.
Dentre os processos citados, a flotação se constitui numa alternativa eficiente para o pré-
tratamento de efluentes líquidos, podendo ser utilizada juntamente com outros procedimentos
para o tratamento de águas residuais contendo óleos, corantes, metais pesados e gorduras.
1.2.4.1. Flotação
A flotação pode ser definida como um processo de separação sólido-líquido onde os
sólidos presentes na suspensão são recuperados pela adesão dos mesmos às bolhas de gás
(geralmente ar), formando um agregado bolha-partícula que ascende na fase aquosa, sendo
recuperado na espuma (LUNA, 2004). Resultados obtidos por Couto et al. (2004) demonstraram
uma eficiência de flotação acima de 90% para um efluente lácteo floculado. Li et al. (2007)
obtiveram uma eficiência de remoção de óleo em águas residuárias de 90%, com uma separação
significativa entre partículas oleosas e bolhas de gás de 96 a 97% em 5 minutos de flotação.
É uma técnica utilizada também em outros campos bem diversificados, como separação
de proteínas, tratamento de líquidos provenientes de processos fotográficos, remoção de odores,
separação e reciclagem de plásticos, clarificação de sucos de frutas e outros (KITCHENER,
1985).
BELO, M.O.M. Degradação hidrolítica dos concentrados obtidos pelo processo de ...
14
Diferentes tipos de sistemas de flotação podem ser aplicados de forma específica a cada
material a ser flotado. Uma das técnicas mais vantajosas é a utilização de colunas de flotação.
Uma coluna de flotação compreende basicamente duas regiões principais: a de coleta e a
de limpeza (Figura 1.1). A região de coleta está compreendida entre o ponto de alimentação da
suspensão e a entrada de ar no sistema, havendo um contato eficiente bolha-partícula tendo em
vista o fluxo em contracorrente. Na região de limpeza, que se situa entre o ponto de alimentação
da suspensão e a adição da água de lavagem, se encontram as partículas não flotáveis que
foram arrastadas pelas bolhas. Estas são forçadas a retornar à região de coleta, sob a ação da
água de lavagem. O fluxo da água de lavagem também força a suspensão alimentada a se mover
descendentemente, evitando a contaminação do produto concentrado no topo da coluna
(SANTOS, 1996).
Figura 1.1 – Representação esquemática de uma coluna de flotação (LUNA, 2004)
O sistema de injeção de ar deve assegurar a distribuição homogênea das bolhas no
interior da coluna e um tamanho de bolha uniforme, de forma a garantir as condições de
estabilidade requeridas no processo. Usualmente, são utilizados dispersores internos, onde o ar
atravessa um meio poroso.
A utilização de colunas de flotação tem se intensificado ao longo dos anos, especialmente
devido a uma série de vantagens, tais como (LUNA, 2004):
BELO, M.O.M. Degradação hidrolítica dos concentrados obtidos pelo processo de ...
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(i) forma de contato entre as fases: a suspensão escoa em contracorrente com as bolhas de ar,
proporcionando um contato mais eficiente entre as bolhas e as partículas;
(ii) a adição de água de lavagem no topo da coluna possibilita o arraste das partículas hidrofílicas
para o fundo, aumentando o teor do material flotado no produto de topo;
(iii) aumento na eficiência de remoção das espécies, especialmente devido a um melhor controle
do tamanho das bolhas;
(iv) maior facilidade de controle da operação, possibilitando a automação do processo;
(v) capazes de flotar partículas menores pela formação de bolhas de menores tamanhos;
(vi) menores custos de investimento e de operação;
(vii) maior capacidade de processamento por área instalada.
1.2.4.2. Tratamento biológico
Os tratamentos biológicos são considerados os processos mais eficientes de remoção da
matéria orgânica em efluentes (VIDAL, CARVALHO, MENDEZ, 2000).
As vantagens dos processos biológicos são: Menor custo quando comparados com os
físico-químicos; possibilidade de mineralização da matéria orgânica presente nos efluentes; os
microrganismos do processo são catalisadores autoreplicantes, ou seja, uma vez desenvolvida
uma biomassa nos reatores e mantidas as condições ideais para sua sobrevivência, esta se
mantém ativa por tempo indeterminado; a maioria dos reatores biológicos não requer um controle
rigoroso dos parâmetros e nem mão-de-obra especializada (PAYNE, 1997).
Os sistemas biológicos podem ser aeróbios ou anaeróbios. O sistema anaeróbio é
caracterizado pela ausência de oxigênio, e consiste na degradação da matéria orgânica pela
ação das bactérias anaeróbias, convertendo-a a metano e compostos inorgânicos como amônia e
dióxido de carbono. Este processo possui várias vantagens como: baixo consumo de energia;
baixos custos de implantação, baixa produção de sólidos; produção de CH
4
(gás combustível com
elevado teor calorífico); aplicabilidade em pequena e grande escala; tolerância a elevadas cargas
orgânicas; baixa demanda de área; baixo consumo de nutrientes; possibilidade de preservação
da biomassa sem alimentação do reator por vários meses e o lodo gerado geralmente é bem
estabilizado (ROSA, 2004).
O tratamento biológico anaeróbio, apresenta problemas na presença de efluentes com
elevados teores de gordura, tais como o desenvolvimento de lodos com baixa atividade,
inadequadas características físicas e com elevada tendência a flotação (PERLE, KIMCHIE,
SHELEF,1995). A degradação destes lipídios é dificultada em sistemas anaeróbios devido à
baixa disponibilidade para os microrganismos, uma vez que os ácidos graxos liberados podem
ser compostos inibitórios nos processos anaeróbios (RINZEMA, BOONE, VAN KNIPPERNBERG
(1994); OMIL, GARRIDO, ARROJO (2003). Além disso, segundo Rinzema, Boone, Van
BELO, M.O.M. Degradação hidrolítica dos concentrados obtidos pelo processo de ...
16
Knippernberg. (1994), os fatores limitantes da taxa de degradação de triacilgliceróis e os
processos de dissolução e de transferência de massa exercem papel fundamental no processo.
Isto porque pode ocorrer adsorção de gorduras na superfície do lodo, dificultando o transporte de
substratos solúveis para a biomassa e levando à queda da taxa de conversão desses substratos
(PETRUY e LETTINGA, 1997).
Vidal et al. (2000) concluíram que a taxa de biodegradação anaeróbia de efluentes ricos
em gordura é lenta devido à composição deste material. Trabalho anterior realizado por
Lefeebvre, Paul, Mauret (1998) afirma que a degradação biológica lenta dos lipídeos se dá
também de forma limitada devido às propriedades físico-químicas das gorduras, como sua
insolubilidade em água e sua solidificação ou semi-solidificação à temperatura ambiente. Além
disso, a utilização de substratos insolúveis pelas células é controlada pela transferência de
substrato da fase insolúvel para a célula, especialmente quando a atividade microbiana é alta. Os
lipídios possuem pouca biodegradabilidade devido à sua baixa biodisponibilidade. O depósito de
elevadas concentrações de gorduras na biomassa causa a queda de eficiência de sistemas de
tratamento biológicos de efluentes contendo altos teores de óleos e graxas. Segundo Masse et al.
(2003), os lipídios representam o componente limitante do tratamento no que diz respeito à
remoção de sólidos em suspensão.
O processo aeróbio de tratamento de águas residuárias consiste na degradação biológica
de substâncias orgânicas complexas na presença de oxigênio livre, onde parte da matéria
orgânica é oxidada a produtos finais para produzir energia para processos vitais e outra parte é
convertida em novas células que, na ausência de matéria orgânica, passam a metabolizar suas
reservas celulares para obter energia, transformando-se nos produtos finais CO
2
, H
2
O e outros.
Elevadas concentrações de lipídios resultam na formação de lodos com diferentes
características físicas e reduzida atividade hidrolítica devido à flotação da biomassa, aumento do
tempo de retenção hidráulica desses efluentes nas lagoas de estabilização, redução da
capacidade de aeradores e elevada demanda de produtos floculantes (MENDES, FREITAS,
CASTRO, 2004).
A etapa de tratamento primário pode ser associada a um tratamento hidrolítico da matéria
orgânica, e este pode ser realizado pela ação de enzimas provenientes dos microrganismos
presentes no efluente. Os microrganismos podem utilizar a matéria orgânica como fonte de
carbono, transformando-as em substâncias químicas simples. Como nem sempre todo o
substrato orgânico sofre decomposição, as técnicas mais utilizadas para estas substâncias mais
resistentes são os processos biológicos, incluindo os processos de lodo ativado, filtro biológico e
lagoas de estabilização aeróbias (LEAL et.al., 2006).
BELO, M.O.M. Degradação hidrolítica dos concentrados obtidos pelo processo de ...
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1.2.4.3. Tratamento enzimático e uso de lipases
A utilização de enzimas em processos de descontaminação ambiental, principalmente no
tratamento de efluentes, foi proposta pela primeira vez na década de 30, mas só nos anos 70
surgiu a idéia da utilização de enzimas para destruição de substâncias específicas. Comparada a
processos ditos convencionais, a utilização de enzimas para tratamento de efluentes e resíduos
oferece como principais vantagens a degradação de compostos tóxicos ou recalcitrantes e a
operacionalidade em faixas mais amplas de concentração de contaminantes, de pH, de
temperatura ou de salinidade. Outras vantagens são a ausência de produção de biomassa, a
não-ocorrência de variações bruscas de carga orgânica (shock loading) e a ausência de período
de aclimatação. Muitos estudos foram realizados nas duas últimas décadas com o objetivo de
investigar novas possibilidades de utilização de enzimas em catálise ambiental. Destes, no
entanto, poucos tiveram efetiva aplicação industrial porque a maior parte teve como principal
objetivo estudar a remoção de compostos específicos, sem abordar os aspectos de engenharia
que, em último caso, determinam a viabilidade do processo (AHUJA, FERREIRA, MOREIRA,
2004).
Dentre os processos enzimáticos que visam à redução da concentração de lipídios
contidos nos efluentes com elevada carga orgânica, destacam-se os que utilizam lipases.
Impulsionadas por sua versatilidade, que permite a catálise de reações de hidrólise e de
síntese, as lipases são biocatalisadores que têm muitas aplicações, razão pela qual a sua
participação no mercado mundial de enzimas industriais cresce significativamente. Estima-se
que, no futuro, elas terão importância industrial comparável à das peptidases, que hoje em dia
representam 25 a 40% das vendas de enzimas industriais (SHARMA, CHIST, BANERJEE, 2001;
HASAN, SHAH e HAMEED, 2006).
As lipases são enzimas classificadas como hidrolases (glicerol éster hidrolases, E. C.
3.1.1.3) que atuam na interface orgânica-aquosa, catalisando a hidrólise de ligações éster-
carboxílicas e liberando ácidos e alcoóis orgânicos, sendo os acilgliceróis seus melhores
substratos (CASTRO, MENDES, SANTOS, 2004). As reações podem ocorrer a partir de
triacilglicerídeos que possuam em sua composição diferentes ácidos graxos, o que pode ser de
grande interesse para o tratamento de efluentes com alto teor de gordura (SAXENA et al., 2003).
De acordo com Haraldsson (1991), a hidrólise de ésteres de triglicerídeos ocorre por
clivagem seqüencial dos grupos acila no glicerídeo, de tal forma, que num dado momento, a
mistura reacional contém não somente triglicerídeo, água, glicerol e ácidos graxos, como também
diacilgliceróis e monoacilgliceróis. A Figura 1.2 ilustra a hidrólise seqüencial dos grupos acila no
glicerídeo catalisada por lipases.
BELO, M.O.M. Degradação hidrolítica dos concentrados obtidos pelo processo de ...
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Figura 1.2 – Hidrólise seqüencial dos grupos acila no glicerídeo catalisada por lipases (Mendes et
al., 2005)
A capacidade das lipases de catalisarem tanto a hidrólise de ésteres quanto reações de
esterificação, interesterificação e transesterificação, permite que estas enzimas sejam utilizadas
na síntese de alcoóis, ácidos carboxílicos e aminas DUAN et al.,(1997); MARSHALL,
CHOBANIAN,YANIC (2001) dando origem a produtos opticamente ativos (ésteres ou amidas) e
ampliando consideravelmente as possibilidades de aplicações comerciais destas enzimas. Por
isso, as lipases são excelentes alternativas para as sínteses químicas clássicas, com aplicação
nas indústrias de alimentos, de detergentes, oleoquímica, farmacêutica, de química fina, de
cosméticos e fragrâncias de polpa e papel, de couro, de biosensores e no tratamento de
efluentes ricos em óleos e graxas (HASAN, SHAH, HAMEED, 2006).
São enzimas comumente encontradas na natureza, podendo ser obtidas a partir de fontes
animais, vegetais e microbianas. Inicialmente, eram obtidas a partir de pâncreas de animais e
usadas como auxiliar digestivo para o consumo humano. No entanto, em função do baixo
rendimento do processo fermentativo, as lipases microbianas tinham também um custo bem mais
elevado quando comparado com outras hidrolases, como proteases e carboxilases. Desta forma,
os recentes avanços registrados na tecnologia do DNA têm permitido aos fabricantes de enzimas
colocarem no mercado de lipases microbianas com atividade elevada e a um custo acessível
(JEGANATHAN, NAKHLA e BASSI, 2006).
Atualmente, as pesquisas com lipases concentram-se na caracterização estrutural, no
mecanismo de ação, na exploração e no aprimoramento de suas propriedades enantioseletivas,
BELO, M.O.M. Degradação hidrolítica dos concentrados obtidos pelo processo de ...
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assim como na clonagem e na expressão de genes de lipases de características interessantes
em organismos de fácil cultivo em larga escala (Almeida et al., 2006). Com auxílio da biofísica, da
cristalografia e da modelagem molecular, cresce o grau de conhecimento sobre a estrutura e a
relação estrutura-função das lipases. HAEFFNER e NORIN (1999) combinaram estudos cinéticos
e de modelagem molecular para obter modelos capazes de explicar e prever a
enantioseletividade das enzimas estudadas. Posteriormente, Ema (2004) descreveu as diferentes
metodologias utilizadas para investigar esta propriedade específica, como o mapeamento de
substratos, a mutagênese sítio-dirigida ou randômica, a análise termodinâmica e a
espectroscopia de massa, dentre outras.
Indústrias como Novozymes
, Amano
e Gist Brocades
são atualmente as maiores
produtoras de lipases. Uma publicação recente sobre a disponibilidade comercial de lipases listou
enzimas de trinta e quatro diferentes fontes, incluindo dezoito a partir de fungos e sete a partir de
bactérias (CASTRO, MENDES, SANTOS, 2004).
Dependendo da fonte, essas enzimas podem ter massa molecular entre 20 e 75 kDa,
atividade em pH na faixa entre 4 a 9 e temperaturas variando desde a ambiente até 70ºC. Estas
enzimas são usualmente estáveis em soluções aquosas neutras à temperatura ambiente,
apresentando em sua maioria uma atividade ótima entre 30 e 40ºC. Contudo, sua
termoestabilidade varia consideravelmente em função da origem, sendo as lipases microbianas
as que possuem maior estabilidade térmica.
Diversos trabalhos têm sido relatados na literatura sobre o uso de lipases para o
tratamento de efluentes ricos em lipídios. Lipases provenientes de Candida rugosa foram
utilizadas no tratamento de resíduos domésticos e na limpeza de tubulações de esgoto, fossas
sépticas e sumidouros. Também foi investigada a utilização de lipases comerciais de diversas
fontes (animal, vegetal e microbiana) no pré-tratamento de efluentes de matadouros (MASSÈ et
al., 2001) e de efluentes de restaurantes por ação de lipase bacteriana (DHARMSTHITI e
KUHASUNTISUK, 1998). Essas enzimas hidrolíticas também foram utilizadas para acelerar a
biodegradação de polímeros e de lamas de perfuração de poços de petróleo contendo ésteres
sintéticos emulsionados em água (ALIPHAT et al.,1998).
O tratamento de efluentes de laticínios foi investigado por Jung et al. (2002), que
utilizaram lipases produzidas por Penicillium restrictum em um reator de lodos ativados de
batelada seqüencial. Os resultados demonstraram que, para concentrações de lipídios acima de
800mg/L, a eficiência de remoção de DQO se manteve acima de 90% para o reator alimentado
com o hidrolisado.
Lipases provenientes do mesmo fungo, produzidas por fermentação no estado sólido,
foram empregadas no pré-tratamento enzimático de efluentes ricos em gorduras oriundos da
BELO, M.O.M. Degradação hidrolítica dos concentrados obtidos pelo processo de ...
20
indústria de laticínios e de abatedouros. Elas foram aplicadas com sucesso em processos
híbridos de tratamento enzimático/biológico dos tipos anaeróbico e aeróbico (CAMMAROTA,
TEXEIRA, FREIRE, 2001; ROSA 2004). Em todos estes trabalhos, a obtenção das enzimas por
fermentação no estado sólido proporcionou custos de produção muito inferiores aos obtidos por
fermentação submersa (CASTILHO et al., 2000). O baixo custo é uma premissa indispensável
para emprego de enzimas no tratamento de rejeitos (CAMMAROTA e FREIRE, 2006), e o uso de
consórcios microbianos produtores de enzimas seria uma alternativa interessante para este fim.
São poucos os trabalhos relatados na literatura sobre o uso de consórcios microbianos,
obtidos a partir de efluentes, e que podem ser utilizados para o tratamento hidrolítico de materiais
ricos em matéria orgânica. MONGKOLTHANARUK e DHARMSTHITI (2002) estudaram a
obtenção de um consórcio microbiano a partir de espécies de comprovada atividade lipolítica
pertencentes aos gêneros Pseudomonas, Bacillus e Acinetobacter. Os microrganismos foram
inoculados em uma água residuária rica em lipídios sob condições controladas de temperatura,
pH e agitação. Os autores obtiveram até 73% de redução de matéria orgânica no efluente após
15 dias de experimento.
Rigoni et al. (2003) avaliaram a eficiência da utilização de uma lipase comercial e de um
pool enzimático na pré-hidrólise dos óleos e gorduras contidos em efluentes de frigoríficos. Foi
observado que o emprego deste pool, por ser proveniente de um rejeito agroindustrial e por ter
apresentado níveis de degradação semelhantes aos atingidos com a lipase comercial, poderia
viabilizar economicamente o processo. Os autores observaram que ainda haveria a necessidade
de testes de biodegradação do efluente hidrolisado para avaliar esse efeito no efluente de
frigorífico.
A remoção de lipídios de efluentes gerados em restaurantes foi verificada por WAKELIN e
FORSTER (1997), empregando culturas puras das espécies Anicetobacter sp., Rhodococcus
rubra, Nocardia amarae, Microthrix parvicella, uma cultura mista chamada MC1 e lodo ativado
aclimatado e não-aclimatado. A espécie Anicetobacter sp. foi a mais eficiente das culturas puras,
removendo 60-65% do teor de lipídios, com uma concentração inicial de 8g/L, enquanto que a
eficiência de remoção de lipídios do efluente pela cultura mista foi de 73%.
1.2.4.4. Mercado de enzimas industriais
No período de 1998 a 2005, o Brasil importou um total de 25.983 toneladas (U$ 226
milhões) de enzimas industriais e produtos relacionados, e exportou 18.442 toneladas (U$ 81
milhões). Os dados sobre o mercado mundial de enzimas foram obtidos do estudo World
Enzymes to 2009, e compilados a partir de fontes primárias e secundárias, como agências
governamentais de estatística, associações comerciais, embaixadas e empresas ligadas ao setor.
BELO, M.O.M. Degradação hidrolítica dos concentrados obtidos pelo processo de ...
21
A indústria mundial de enzimas obteve um faturamento total de U$3,7 bilhões em 2004,
com previsão de crescimento da demanda mundial em 6,5% ao ano até 2009. Países como a
China, Índia e Coréia do Sul apresentaram as maiores oportunidades de crescimento no setor.
Em termos de divisão geográfica do consumo de enzimas, os Estados Unidos da América
respondem a 34% do mercado, configurando-se como o maior consumidor.
O mercado das enzimas está dividido em dois grandes segmentos: enzimas industriais
(enzimas técnicas, enzimas para a indústria de alimentos e enzimas para ração animal) e
enzimas especiais (enzimas terapêuticas, enzimas para diagnóstico, enzimas para química quiral
e enzimas para pesquisa). Em termos percentuais, as enzimas de uso industrial representam
mais de 60% do mercado mundial de enzimas. Para os próximos 10 anos, espera-se um
crescimento na participação de enzimas especiais, atingindo uma proporção de 42,6% em 2014.
BELO, M.O.M. Degradação hidrolítica dos concentrados obtidos pelo processo de ...
22
1.3 Objetivos
1.3.1 Objetivo Geral
Utilizar lipase e/ou consórcios microbianos com atividade lipolítica visando à degradação
hidrolítica dos concentrados obtidos pelo processo de flotação de efluente da indústria láctea.
1.3.2 Objetivos Específicos
- Realizar a caracterização microbiológica e físico-química de um efluente lácteo industrial
(soro de queijo);
- Obter um consórcio microbiano a partir de cultivo do efluente em biorreator e avaliar a
cinética de crescimento celular e remoção de DQO;
- Investigar a produção de lipase por consórcio microbiano no efluente;
- Determinar as melhores condições da reação de hidrólise do material flotado por
lipase/consórcio microbiano, através da utilização do planejamento experimental.
BELO, M.O.M. Degradação hidrolítica dos concentrados obtidos pelo processo de ...
23
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BELO, M.O.M. Degradação hidrolítica dos concentrados obtidos pelo processo de ...
29
CAPÍTULO 2
Caracterizações microbiológica e físico-química de efluente lácteo
visando à obtenção de consórcio microbiano
Micheline Oliveira de Menezes Belo; Caroline Correia Guirelli; Alexandra Amorim Salgueiro;
Christine Lamenha Luna-Finkler
*
Universidade Católica de Pernambuco; Rua do Príncipe, 526, Boa Vista, 50050-900
Recife, PE; Brasil.
E-mail: [email protected]
* Autor para correspondência.
BELO, M.O.M. Degradação hidrolítica dos concentrados obtidos pelo processo de ...
30
RESUMO
Neste trabalho, um efluente lácteo industrial foi caracterizado em termos microbiológicos e físico-
químicos e utilizado para a obtenção de um consórcio de microrganismos visando a sua
biodegradação. Para a caracterização microbiológica foram determinadas a contagem padrão de
bactérias heterotróficas e as contagens de fungos filamentosos e leveduras de acordo com as
metodologias oficiais. A caracterização físico-química foi realizada em termos do teor de
proteínas, cinzas, lipídios, carboidratos, pH e demanda química de oxigênio (DQO). O consórcio
microbiano foi obtido em biorreator operando em batelada e contendo 1,5L do efluente, a 200rpm,
aeração de 1vvm e temperatura de 28 - 30
o
C. Os cultivos foram realizados em duplicata durante
onze dias, sendo realizado um pulso de 150mL do efluente (10% do volume útil do biorreator) no
sétimo dia do cultivo, sendo determinada a cinética de crescimento celular, concentração de DQO
e atividade lipolítica. Foram obtidas concentrações iniciais de 3x10
9
UFC/mL e 8x10
4
UFC/mL para
contagem total de bactérias e de fungos e leveduras, respectivamente. O efluente apresentou
uma DQO inicial de 64.000mgO
2
/L, pH 5,0, e concentrações correspondentes a 5% de
carboidratos, 0,8% de proteínas e 0,6% de lipídios. Os cultivos do efluente no biorreator
demonstraram um aumento da concentração de bactérias ao longo do tempo, atingindo
1x10
13
UFC/mL após oito dias, enquanto que as concentrações de fungos filamentosos e de
leveduras foram inibidas. Foi observada uma redução da DQO de 47 a 63,5% após 11 dias de
cultivo, demonstrando a potencialidade da utilização do consórcio microbiano no tratamento do
efluente. Ensaios qualitativos demonstraram a presença das enzimas lipase, amilase, protease e
celulase no extrato metabólito do consórcio microbiano. No entanto, foram obtidos baixos valores
de atividade lipolítica quando comparados com a atividade da enzima comercial, sendo
observado ainda que a atividade decresce ao longo do tempo.
Palavras-chave: efluente lácteo, caracterização microbiológica, caracterização físico-química,
consórcio microbiano, lipase; hidrólise.
BELO, M.O.M. Degradação hidrolítica dos concentrados obtidos pelo processo de ...
31
ABSTRACT
In this work, a dairy effluent was characterized in terms microbiological and physical-chemical and
used to obtain a microbial consortium. Microbiological characterization was performed by total
heterotrophic bacteria, filamentous fungi and yeasts count according to the official methodologies.
Physical-chemical characterization was accomplished by content of protein, ash, lipids,
carbohydrates, pH and chemical oxygen demand (COD). Microbial consortium was obtained in
batch using a bioreactor containing 1,5L of dairy effluent, at 200 rpm, 1vvm, at 28 - 30
o
C.
Cultivations were performed in duplicate for eleven days, being applied a pulse of 10% (v/v) of
effluent on the seventh day of the experiment. Cellular growth kinetics, chemical oxygen demand
concentration and lipolytic activity were determined. Initial concentrations of bacteria and fungi
and yeasts were equal to 3x10
9
CFU/mL and 8x10
4
CFU/mL, respectively. Effluent presented a
COD of 64.000mgO
2
/L, pH 5,0 and concentrations of 5% of carbohydrates, 0,8% of protein and
0,6% of lipids. Cultivations showed an increase on the bacteria concentration, reaching
1x10
13
CFU/mL after eight days, while filamentous fungi and yeast concentrations were inhibited.
An reduction of COD concentration in the range of 47 to 63,5% was observed after eleven days of
cultivation, demonstrating the potentiality of use of microbial consortium for effluent treatment.
Qualitative assays showed the presence of the enzymes: lipase, amylase, protease and cellulase
in the metabolic extract of the microbial consortium. However, low values of lipolytic activity were
obtained as compared to the commercial enzyme, being observed that activity decrease along
time.
Keywords: dairy effluent, microbiological characterization, physical-chemical characterization,
microbial consortium, lipase, hydrolysis.
BELO, M.O.M. Degradação hidrolítica dos concentrados obtidos pelo processo de ...
32
2.1. INTRODUÇÃO
O desenvolvimento de processos capazes de minimizar os problemas ocasionados por
muitos efluentes industriais é um desafio da biotecnologia ambiental. Um dos principais
problemas encontrados é o tratamento de efluentes contendo elevados teores de lipídios, tais
como os originados da indústria de laticínios.
Raunkjaer et al. (1994) e JAGANATHAN, BASSI, NAKHA (2006) relataram que os lipídios,
juntamente com proteínas e carboidratos, compõem os principais compostos orgânicos de águas
residuárias de diversas indústrias de alimentos e até mesmo da indústria de ração animal, sendo
esta uma das maiores produtoras de efluentes ricos em óleos e gorduras. Esses compostos
causam grandes danos ao meio ambiente, como a formação de filmes de óleos nas superfícies
aquáticas que dificultam a dispersão de luz e a conseqüente difusão de oxigênio para o meio,
causando danos à biota local, conforme descrito por MONGKOLTHANARUK e DHARMISTHITI
(2002). As principais fontes de geração de lipídios são indústrias de óleos comestíveis, sorvetes,
laticínios, curtumes, matadouros e os efluentes domésticos e de restaurantes.
De acordo com MENDES, CASTRO, PEREIRA, (2005), a concentração de lipídios em
efluentes lácteos atinge valores em torno de 4.680mg/L. Glazer e Nikaido (1995) relataram que a
Demanda Bioquímica de Oxigênio (DBO) para efluentes de laticínios sem recuperação do soro de
queijo varia de 40.000 a 48.000mg/L, superior aos valores encontrados para efluentes de
alimentos enlatados e de cervejarias (500-2.000mg/L), efluentes de processamento de óleo
comestível, vinhaça e chorume (15.000-20.000mg/L) e efluente de matadouros (30.000mg/L).
Em sistemas de tratamento biológico, o elevado teor de lipídios dificulta a sedimentação
do lodo, demanda maior tempo de retenção e aeração, além de dificultar a operação do reator de
digestão anaeróbia (UASB) devido à formação de caminhos preferenciais no leito de lodo e
arraste da biomassa, levando à perda da eficiência e até mesmo ao colapso do reator (Leal,
(2000); HU, THAYANITHY, FOSTER (2002). Em sistemas de tratamento físico-químico, é
necessária uma maior quantidade de produtos floculantes com significativo aumento na geração
do lodo (LIE e MOLIN, 1991). De acordo com Cammarota e Freire (2006), a aplicação de um
processo de pré-tratamento para hidrólise de gorduras pode melhorar a degradação biológica de
efluentes gordurosos, acelerando o processo e reduzindo o tempo de tratamento.
Segundo Rajeahwari et. al (2000), no tratamento de efluentes gordurosos, os lipídios
representam em torno de 50% da DQO do resíduo. A utilização de enzimas pode ser de grande
interesse no tratamento destes efluentes. No entanto, o elevado custo das enzimas comerciais
disponíveis muitas vezes inviabiliza o processo, e a utilização de consórcios microbianos com
atividade enzimática, obtidos a partir do próprio efluente, torna-se uma alternativa promissora no
BELO, M.O.M. Degradação hidrolítica dos concentrados obtidos pelo processo de ...
33
tratamento eficiente destes resíduos. Em trabalho realizado por Mongkolthanaruk e Dharmsthiti
(2002), foi demonstrado que as bactérias Pseudomonas aeruginosa-LP602, Bacillus sp.-B304 e
Acinetobacter calcoaceticus-LP009 são eficientes na redução de DBO e do conteúdo de lipídios,
provavelmente devido à produção de lipases. Masse, Kennedy, Chou (2001) descreveram que
este tipo de tratamento apresenta algumas vantagens, tais como a não-geração de produtos
tóxicos, condições moderadas de operação e redução de custo em termos de energia, tornando o
processo atrativo do ponto de vista econômico e ambiental.
Neste contexto, o objetivo do presente trabalho foi caracterizar um efluente lácteo
industrial em termos microbiológicos e físico-químicos e a obtenção de um consórcio de
microrganismos com potencial atividade enzimática para a biodegradação deste efluente. Os
resultados visam contribuir para o desenvolvimento de tecnologia de tratamento hidrolítico de
águas residuárias da indústria láctea e de efluentes ricos em lipídios.
2.2. MATERIAIS E MÉTODOS
2.2.1. Coleta e acondicionamento do efluente
A empresa fornecedora do efluente está localizada no município de São Bento do Una/PE
e caracteriza-se como uma microempresa de caráter familiar, produtora de quatro diferentes tipos
de queijo (coalho, muzzarela, ricota e manteiga), com produção média diária de 500kg, 300kg,
100kg e 200kg, respectivamente. A empresa também é produtora de outros derivados, como
requeijão, doce de leite, manteiga e bebidas lácteas de vários sabores.
Foram coletados 50L do efluente, proveniente do processo industrial da fabricação do
queijo de coalho, sem qualquer tipo de tratamento prévio, sendo a amostra transportada sob
refrigeração em recipientes de polietileno com capacidade volumétrica de 20L. Uma amostra
estéril de 250mL foi coletada de acordo com os padrões estipulados pela APHA (1992), visando a
caracterização microbiológica do efluente.
As amostras foram homogeneizadas, distribuídas em garrafas plásticas limpas e não
estéreis de 2L de capacidade e congeladas à temperatura de -20°C no Núcleo de Pesquisas em
Ciências Ambientais (NPCIAMB) da Universidade Católica de Pernambuco.
2.2.2. Caracterização microbiológica
A contagem de bactérias heterotróficas foi realizada utilizando o meio de cultura para
contagem padrão, que apresenta a seguinte composição (g/L): triptona 5g; extrato de levedura
BELO, M.O.M. Degradação hidrolítica dos concentrados obtidos pelo processo de ...
34
2,5g; glicose 1g; Agar 15 g; pH 7,0. As amostras foram diluídas utilizando-se água tamponada
sendo empregada a técnica “pour plate”, com incubação das amostras a 35ºC por 48h (APHA,
1992). Os experimentos foram realizados em triplicata.
A contagem de fungos e leveduras foi realizada utilizando meio de cultura (g/L): extrato de
malte 30 g; peptona 5 g; cloranfenicol 0,1 g; Agar 15 g; pH 5,4. Após diluição da amostra, um
volume de 0,1 mL foi inoculado em placas de Petri e espalhado com o auxílio de uma alça de
Drigalski. As amostras foram incubadas a 20ºC por 2 dias para a contagem de leveduras e por 5
– 7 dias para os fungos filamentosos (APHA, 1992). Os experimentos foram realizados em
triplicata.
2.2.3. Caracterização físico-química
O efluente foi caracterizado em termos do teor de proteínas, cinzas, lipídios e
carboidratos, sendo a análise realizada através do método Adolfo Lutz (2005) no Laboratório de
Experimentação e Análises de Alimentos (LEAL) do Departamento de Nutrição da Universidade
Federal de Pernambuco.
A Demanda Química de Oxigênio (DQO) foi determinada de acordo com metodologia da
APHA (1992) pelo método de refluxo fechado utilizando a solução digestora de dicromato de
potássio como oxidante. As análises foram realizadas em triplicata.
A determinação do pH foi realizada através da leitura instrumental de um pHmetro digital
(ORION, modelo 20A). Após a calibração com soluções tampões de pH 4,0 e 7,0, o eletrodo de
vidro foi imerso em um béquer com aproximadamente 50mL da amostra, fornecendo diretamente
o resultado através do mostrador digital.
2.2.4. Obtenção do consórcio microbiano
O consórcio microbiano foi obtido a partir de cultivo do efluente em biorreator de 2L de
capacidade e 1,5L de volume útil, operando sob agitação mecânica de 200rpm, aeração de 1vvm
e temperatura de 28 - 30
o
C (Figura 2.1). Os cultivos foram realizados em duplicata.
Cada reator permaneceu em funcionamento durante onze dias, sendo realizado um pulso
corresponde a 10% (v/v) do volume do biorreator no sétimo dia de experimento. A adição do
efluente bruto após o crescimento dos microrganismos visa investigar a eficácia do consórcio
microbiano em degradar a matéria orgânica para possível aplicação como inóculo em tratamento
biológico do efluente. Foram retiradas amostras em duplicata de aproximadamente 10mL, sendo
BELO, M.O.M. Degradação hidrolítica dos concentrados obtidos pelo processo de ...
35
armazenadas em freezers para posterior análise da cinética de crescimento celular, determinação
da DQO, avaliação qualitativa de atividades enzimáticas e atividade lipásica.
Figura 2.1 - Biorreator contendo efluente lácteo para obtenção do consórcio microbiano
2.2.5. Avaliação qualitativa da atividade enzimática
As atividades enzimáticas das amostras coletadas no reator foram determinadas por meio
do método de difusão em Agar, baseado na metodologia de Hankin e Anagnostakis (1975),
sendo investigadas as enzimas: celulases, amilases, proteases e lipases.
O meio de cultura para determinação de celulases apresentou a seguinte composição, em
(g/L): KCl 3,8g; K
2
HPO
4
2,0g; MgSO
4
.7H
2
O 0,1g; (NH
4
)
2
SO
4
1,0g; extrato de malte 0,5g;
carboximetilcelulose 10,0g; Agar 15,0g; pH 7,0. O meio de cultura para determinação de amilases
foi o Agar nutritivo (AN), de composição em (g/L): peptona 5,0g; extrato de carne 3,0g; Agar
15,0g; contendo amido 2,0g a pH 7,3, enquanto que o meio de cultura para determinação de
proteases foi o AN, contendo gelatina a 8%(p/v). O meio de cultura para determinação de lipases
foi de composição, em (g/L): peptona 10,0g; NaCl 5,0g; CaCl
2
.2H
2
O 0,1g; Agar 15,0g; tween-20
10mL; pH 6,0. As atividades enzimáticas foram expressas de forma qualitativa, indicando-se a
ausência de atividade (-) e teste positivo cuja intensidade de atividade foi proporcional ao número
de (+).
BELO, M.O.M. Degradação hidrolítica dos concentrados obtidos pelo processo de ...
36
2.2.6. Atividade lipásica
A atividade lipásica foi avaliada de acordo com Vorderwulbecke, Kieslich, Erdmann
(1992), utilizando o lipídio paranitrofenilpalmitato (pNPP) que, por hidrólise, produz ácido
palmítico e um derivado de coloração amarela. Este é espectrofotometricamente determinado
avaliando-se a coloração formada por unidade de tempo. As velocidades máximas das reações
enzimáticas foram calculadas em função das leituras de absorbâncias medidas a 410nm, sendo
determinadas as atividades lipásicas utilizando-se o coeficiente de absorção molar do pNPP
(15mmol
-1
.cm
-1
). Para realização das análises as amostras coletadas no biorreator foram
centrifugadas a 4000rpm durante 10min (extrato bruto), sendo as análises realizadas em
triplicata. As medidas foram realizadas a cada 2 minutos em espectrofotômetro (Libra S32-
Biochrom), por um total de 10min. Os resultados foram comparados com a atividade lipásica de
uma lipase comercial (lipolase), obtida da Novozymes®. A Unidade Internacional (UI) de atividade
enzimática é definida como a quantidade de enzima que catalisa 1µmol de substrato por minuto
nas condições da reação (pH 8,0; 28
o
C). Os experimentos foram realizados em triplicata.
2.3. RESULTADOS E DISCUSSÃO
As Figuras 2.2 e 2.3 mostram os resultados de contagem de bactérias heterotróficas e de
fungos e leveduras, respectivamente, durante os cultivos do efluente no biorreator. Foi observado
um aumento da concentração de bactérias ao longo do tempo, atingindo cerca de 1x10
13
UFC/mL
após oito dias, enquanto que a população de fungos e leveduras foi inibida. Elevados valores
iniciais de concentração de células foram observados, sendo de 3x10
9
UFC/mL para bactérias
heterotróficas e de 8x10
4
UFC/mL para fungos e leveduras.
A elevada concentração microbiana no efluente bruto sugere que este pode apresentar
grande potencial biotecnológico considerando a possibilidade de obtenção de um consórcio
microbiano com atividade enzimática. Por outro lado, a caracterização microbiológica relativa à
quantificação do número total de bactérias, leveduras e fungos filamentosos demonstrou que o
processo industrial possivelmente não se encontra adequado sob o ponto de vista higiênico-
sanitário, tendo em vista o alto número de microrganismos determinados no efluente.
BELO, M.O.M. Degradação hidrolítica dos concentrados obtidos pelo processo de ...
37
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
10
8
10
9
10
10
10
11
10
12
10
13
10
14
Bactérias heterotróficas (UFC/mL)
Tempo (dia)
Cultivo A
Cultivo B
Figura 2.2 - Resultados de contagem de bactérias heterotróficas durante cultivo do efluente lácteo
em biorreator (200rpm, 1vvm, 28-30
o
C)
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
0,0
2,0x10
4
4,0x10
4
6,0x10
4
8,0x10
4
1,0x10
5
Cultivo A
Fungos e leveduras (UFC/mL)
Tempo (dia)
Figura 2.3 - Resultados de contagem de fungos e leveduras durante cultivo do efluente lácteo em
biorreator (200rpm, 1vvm, 28-30
o
C)
Os resultados referentes à caracterização físico-química do efluente são mostrados na
Tabela 2.1. Pode ser observado que a concentração total de matéria orgânica presente, incluindo
proteínas, lipídios e carboidratos, foi equivalente a 5,98g/100g. O alto valor nutritivo desse
BELO, M.O.M. Degradação hidrolítica dos concentrados obtidos pelo processo de ...
38
efluente está representado pela proporção de 1:6 entre a fonte de nitrogênio constituída pelas
proteínas e a fonte de carbono, formada por carboidratos mais lipídios. Estes resultados indicam
que o efluente lácteo pode favorecer o cultivo de grande número de microrganismos, como
descrito por Nitschke, Rodrigues, Schinatto (2001) para Xanthomonas campestris, por Silva
(2006) para Bacillus sp. e por Podlech et al. (1991) para Lactobacillus, quando utilizaram soro de
leite na composição de meios de cultivo.
Tabela 2.1 - Caracterização físico-química do soro de queijo
Características Valor
Umidade e substâncias voláteis (g/100g) 93,45
Proteínas (g/100g) 0,83
Cinzas (g/100g) 0,57
Lipídios (g/100g) 0,60
Carboidratos (g/100g) 4,55
DQO (mg O
2
/L) 64.000
pH 5,0
Os valores referentes às concentrações de proteínas, lipídios e DQO obtidos no presente
trabalho foram superiores aos reportados na literatura. Lyberatos, Gavala, Stamatematou (1997)
obtiveram uma concentração de proteínas de 0,63g/100mL e uma DQO de 60.271mg O
2
/L em
efluentes de laticínios. Em trabalho realizado por Mendes, Pereira, Castro (2006), foi
caracterizado um efluente bruto colhido à jusante da descarga de uma indústria de laticínios com
volume de descarte numa vazão de 110 m
3
/dia, sendo obtidos valores de 0,57g/100mL para
proteínas, 0,47g/100mL para lipídios, DQO de 52.500mg O
2
/L e pH do efluente de 5,25. Os
mesmos autores descrevem que os principais ácidos graxos de cadeia longa presentes no
efluente foram o palmítico, em maior concentração, seguido do oléico, esteárico e mirístico.
A Resolução N
o
357 de 17 de março de 2005 do Conselho Nacional de Meio Ambiente -
CONAMA, estabelece que o efluente industrial, ao ser incorporado a um corpo hídrico, não
poderá alterar a qualidade da água do corpo hídrico receptor (Brasil, 2005). Os elevados valores
observados para as concentrações de microrganismos e de DQO no efluente em estudo indicam
a necessidade de implementação de um sistema de tratamento de efluentes de forma a tender às
exigências ambientais e da legislação. Além disso, o tratamento de efluentes na produção de
alimentos tem o objetivo não somente de minimizar a poluição ambiental, como de prevenir a
contaminação do alimento durante o processo produtivo.
O principal parâmetro para avaliar se um tratamento foi eficiente ou não é a remoção de
matéria orgânica, que neste trabalho foi quantificada em termos de DQO. De acordo com a
Figura 2.4, pode ser observado que os valores de DQO decrescem ao longo do tempo de cultivo,
atingindo valores entre 22.000 e 32.000mg O
2
/L após 11 dias, sendo equivalente a uma redução
BELO, M.O.M. Degradação hidrolítica dos concentrados obtidos pelo processo de ...
39
entre 47,0 a 63,5%. Em trabalho realizado por Dors et al. (2007), foi obtida uma remoção de DQO
de 31% para um efluente de uma indústria frigorífica de abate de frango, enquanto que com o uso
de lipases pancreáticas em concentrações variando de 0,1 a 0,35%, os índices de remoção de
DQO variaram de 88 a 95%.
0123456789101112
15000
20000
25000
30000
35000
40000
45000
50000
55000
60000
65000
70000
75000
Cultivo A
Cultivo B
DQO (mgO
2
/L)
Tempo (dia)
Figura 2.4 - Demanda Química de Oxigênio (DQO) durante o cultivo do efluente lácteo em
biorreator (250 rpm, 1vvm, 30ºC).
A Tabela 2.2 ilustra os resultados de avaliação qualitativa da atividade enzimática. Todas
as atividades aumentaram proporcionalmente aos dias de cultivo do consórcio microbiano. As
atividades de amilases, celulases, lipases e proteases determinadas no cultivo submerso do
efluente lácteo durante a obtenção do consórcio microbiano podem representar um potencial
enzimático para a biodegradação do elevado conteúdo de matéria orgânica presente nesse
efluente.
Com o objetivo de avaliar a potencialidade da produção de lipases pelo consórcio
microbiano, a atividade lipásica das amostras foi quantificada ao longo do cultivo no biorreator e
os resultados estão apresentados na Figura 2.5. Foram obtidos baixos valores de atividade
lipásica quando comparados com a atividade da enzima comercial (2.124 ± 190UI/mL), sendo
observado ainda que a atividade decresce ao longo do tempo.
BELO, M.O.M. Degradação hidrolítica dos concentrados obtidos pelo processo de ...
40
Tabela 2.2 - Resultados de atividades enzimáticas das amostras do consórcio microbiano obtido
a partir do cultivo em soro de queijo
Tempo
(dia)
Amilase Celulase Lipase Protease
0 ++ - - -
1 ++ - - +
2 ++ + + ++
3 ++ + + +++
4 +++ + ++ +++
7 +++ ++ ++ +++
8 +++ +++ +++ +++
9 +++ +++ +++ +++
10 +++ +++ +++ +++
11 +++ +++ +++ +++
Ausência de atividade (-)
Teste positivo cuja intensidade de atividade foi proporcional ao número de (+).
0123456789101112
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Cultivo A
Cultivo B
Atividade lipásica (UI/L)
Tempo (dia)
Figura 2.5 – Resultados de atividade lipásica durante cultivo do efluente lácteo em biorreator
(250rpm, 1vvm, 30ºC).
Tendo em vista a redução da DQO observada, a hidrólise da matéria orgânica contida no
efluente pode ser creditada à presença de outras enzimas, como proteases e amilases,
considerando que os efluentes das indústrias de derivados lácteos contêm, além de lipídios, altos
teores de proteínas provenientes do leite (caseína) e de carboidratos.
BELO, M.O.M. Degradação hidrolítica dos concentrados obtidos pelo processo de ...
41
2.4. CONCLUSÕES
O efluente lácteo estudado no presente trabalho apresentou um elevado teor de DQO
quando comparado com a literatura, e suas características físico-químicas favorecem a obtenção
de um consórcio microbiano sob condições aeróbias. Os resultados demonstram que o consórcio
obtido apresenta atividade enzimática, embora a atividade lipásica tenha sido muito inferior
quando comparada com a atividade de uma enzima comercial.
A redução da DQO do efluente demonstra a potencialidade da utilização do consórcio
microbiano visando o tratamento do efluente lácteo, salientando-se a necessidade de estudos
posteriores para a avaliação da eficiência do consórcio sob condições otimizadas.
Agradecimentos
Os autores agradecem ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e
Tecnológico – CNPq, pelo apoio financeiro (número de processo 485292/2006-8) e concessão de
bolsa de Iniciação Científica, a Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior –
CAPES, pela concessão de bolsa de mestrado, e à empresa Laticínios São Bento, pela doação
do soro de leite.
2.5. REFERÊNCIAS
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Wastewater. 18. ed., Washington: APHA, 1992.
BRASIL. CONAMA - Conselho Nacional do Meio Ambiente. Resolução nº 357/2005.
www.mma.gov.br/port/conama/res/res05/res35705.pdf. 02 Abril 2008.
CAMMAROTA, M.C.; FREIRE, D.M.G. A review on hydrolytic enzymes in the treatment of
wastewater with high oil and grease content. Bioresource Technology, v. 97, p. 2195–2210,
2006.
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Simultâneas no Tratamento de Águas Residuárias Ricas em Lipídeos, XVI Simpósio Nacional de
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Semicontinuos fermentation of whey by Lactobacillus bulgaris I. Experimental results.
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RAJESHWARI, K.V.; BALAKRISHNAN, M.; KANSAL, A.; LATA, K. & KISHORE, V.V.N.,
Anaerobic digestion technologies for energy recovery from industrial wastewater – a study in
indian context. Renewable & Sustainable Energy Reviews, v.4, p.135-156, 2000
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Mestrado, Universidade Estadual do Norte Fluminense, Rio de Janeiro, RJ.
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assays. Enzyme and Microbial Technology, v. 14, p. 631-639, 1992.
BELO, M.O.M. Degradação hidrolítica dos concentrados obtidos pelo processo de ...
44
CAPÍTULO 3
Degradação hidrolítica de material flotado de efluente lácteo industrial
Micheline Oliveira de Menezes Belo; Alexandra Amorim Salgueiro;
Christine Lamenha Luna-Finkler*
Universidade Católica de Pernambuco; Rua do Príncipe, 526, Boa Vista, 50050-900 - Recife, PE;
Brasil.
E-mail: [email protected]
* Autor para correspondência.
BELO, M.O.M. Degradação hidrolítica dos concentrados obtidos pelo processo de ...
45
RESUMO
Os elevados teores de lipídios presentes em efluentes de laticínios podem afetar o desempenho
do tratamento biológico, e a hidrólise enzimática pode vir a contribuir para o aumento da
biodegradação de efluentes gordurosos, aumentando a eficiência dos processos de tratamento
biológico. Neste contexto, o objetivo do presente trabalho foi avaliar a hidrólise enzimática de
material flotado, obtido a partir do processo de flotação em coluna de efluente lácteo industrial
(soro de queijo), utilizando a técnica de planejamento de experimentos. Inicialmente, foi avaliado
o desempenho de uma lipase comercial (lipolase®), sendo investigados os efeitos da agitação e
da concentração de enzima sobre a hidrólise. Foi realizada a análise estatística considerando-se
os efeitos significativos a um nível de confiança de 95%, sendo verificado que concentrações
maiores de enzima dentro da faixa investigada (1 a 7%) maximizam a hidrólise de óleos e
gorduras do material flotado, bem como para níveis de agitação entre 100 e 150rpm. Em todos os
experimentos houve a liberação de ácidos graxos no meio em percentuais próximos a 100%
apenas após 4 horas de reação. Vale salientar ainda que percentuais de liberação de ácidos
graxos superiores a 92% foram obtidos para toda a faixa de concentração testada. Uma agitação
de 150rpm foi utilizada em um segundo planejamento experimental, avaliando-se a concentração
da enzima comercial associada a um consórcio microbiano. O acompanhamento cinético do
processo mostrou que a adição do consórcio não influenciou de maneira positiva o aumento do
teor de ácidos graxos livres no meio. Ensaios adicionais são ainda necessários para avaliar o
efeito da adição da enzima em menores concentrações sobre a hidrólise do material flotado de
efluente de laticínios.
Palavras-chave: hidrólise, efluente lácteo, flotado, lipase, consórcio microbiano.
BELO, M.O.M. Degradação hidrolítica dos concentrados obtidos pelo processo de ...
46
ABSTRACT
The high levels of lipids in the dairy effluents can affect the performance of biological treatment,
and enzymatic hydrolysis could contribute to increased degradation of fatty waste, increasing the
efficiency of biological treatment. In this context, the objective of this study was evaluating
enzymatic hydrolysis of floated material, obtained from the column flotation using a dairy industry
using the technique of experimental design. Initially, performance was evaluated by a commercial
lipase (lipolase®), being investigated the effects of agitation and enzyme concentration on
hydrolysis. A statistical analysis was performed considering the significance of effects to a
confidence level of 95%. Higher enzyme concentrations in the range investigated (1 to 7%)
maximize the hydrolysis of oils and fats in the floated material, and to agitation levels between 100
and 150rpm. In all experiments, fatty acids were released in rates near to 100% only after 4 hours
of reaction. Moreover, rates of released fatty acids were greater than 92% in all the concentration
range tested. An agitation of 150rpm was used in a second experimental design, evaluating the
concentration of commercial enzyme associated with a microbial consortium. The kinetic
monitoring of the process showed that the addition of the consortium did not influence in a positive
manner the increase the content of free fatty acids. Additional tests are needed to evaluate the
effect of the enzyme addition at lower concentrations on the hydrolysis of floated material from the
dairy effluent.
Keywords: hydrolysis, dairy effluent, floated, lipase, microbial consortium.
BELO, M.O.M. Degradação hidrolítica dos concentrados obtidos pelo processo de ...
47
3.1. INTRODUÇÃO
Os efluentes gerados pelas indústrias de laticínios são caracterizados por uma elevada
concentração de matéria orgânica, principalmente no que diz respeito aos lipídios, o que dificulta
as formas de tratamento que visam diminuir a sua carga poluidora antes de serem lançados nos
corpos hídricos receptores.
Inicialmente, o tratamento de efluentes líquidos industriais contendo sólidos em suspensão (como
é o caso dos efluentes lácteos) é realizado pelo emprego de métodos primários de tratamento
com o objetivo de remover o material sólido em suspensão e/ou flutuante. Dentre as principais
técnicas utilizadas no tratamento primário destaca-se a flotação.
A flotação surge como uma alternativa eficiente para o pré-tratamento de efluentes
líquidos, podendo ser utilizada juntamente com outros procedimentos para o tratamento de águas
residuais contendo óleos, corantes, metais pesados e gorduras (LUNA, 2004). Encontra
aplicação na separação de proteínas, tratamento de líquidos provenientes de processos
fotográficos, remoção de odores, separação e reciclagem de plásticos, clarificação de sucos de
frutas e outras (KITCHENER, 1985).
A etapa de tratamento primário por flotação gera um material flotado que possui uma
característica sólida ou semi-sólida, e o tratamento deste resíduo pode ser realizado por hidrólise
pela ação de enzimas comercialmente disponíveis ou provenientes dos microrganismos
presentes no efluente. Os microrganismos podem utilizar a matéria orgânica como fonte de
carbono, transformando-as em substâncias químicas simples. (KITCHENER, 1985).
O uso de enzimas comerciais também pode ser empregado, no entanto, apresenta um
custo elevado.
O pré-tratamento enzimático apresenta algumas vantagens, tais como o controle dos
produtos, condições moderadas de operação, redução de custo em termos de energia e de
equipamentos, tornando este processo atrativo sob o ponto de vista ambiental (MASSE,
KENNEDY, CHOU 2001). A aplicação de lipases é particularmente importante devido ao fato da
hidrólise ser específica em óleos e graxas, o que representa grande interesse para diferentes
aplicações industriais (LEAL et al., 2006).
Ringoni et al. (2003) avaliaram a eficiência da utilização de uma lipase comercial e de um
pool enzimático na pré-hidrólise dos óleos e gorduras contidos em efluentes de frigoríficos. Foi
observado que o emprego deste pool, por ser proveniente de um rejeito agroindustrial e por ter
apresentado níveis de degradação semelhantes aos atingidos com a lipase comercial, poderia
viabilizar economicamente o processo. Os autores observaram que ainda haveria a necessidade
BELO, M.O.M. Degradação hidrolítica dos concentrados obtidos pelo processo de ...
48
de testes de biodegradação do efluente hidrolisado para se avaliar esse efeito no efluente de
frigorífico.
São poucos os trabalhos relatados na literatura sobre o uso de consórcios microbianos,
obtidos a partir de efluentes, e que podem ser utilizados para o tratamento hidrolítico de materiais
ricos em matéria orgânica. Mongkolthanaruk e Dharmsthiti (2002) estudaram a obtenção de um
consórcio microbiano a partir de espécies de comprovada atividade lipolítica pertencentes aos
gêneros Pseudomonas, Bacillus e Acinetobacter, e inocularam estes microrganismos em uma
água residuária rica em lipídios sob condições controladas de temperatura, pH e agitação. Os
autores obtiveram até 73% de redução de matéria orgânica no efluente após 15 dias de
experimento.
O objetivo do presente trabalho é avaliar a hidrólise de material flotado proveniente de um
processo de flotação em coluna utilizando uma lipase comercial (lipolase®) associada a um
consórcio microbiano, obtido a partir de um efluente lácteo industrial.
3.2. MATERIAIS E MÉTODOS
3.2.1. Coleta e acondicionamento do efluente
A empresa fornecedora do efluente está localizada no município de São Bento do Una/PE
e caracteriza-se como uma microempresa de caráter familiar, produtora de quatro diferentes tipos
de queijo (coalho, muzzarela, ricota e manteiga), com produção média diária de 500kg, 300kg,
100kg e 200kg, respectivamente. A empresa também é produtora de outros derivados, como
requeijão, doce de leite, manteiga e bebidas lácteas de vários sabores.
Foram coletados 50L do efluente, proveniente do processo industrial da fabricação do
queijo de coalho, sem qualquer tipo de tratamento prévio, sendo a amostra transportada sob
refrigeração em recipientes de polietileno com capacidade volumétrica de 20L.
As amostras foram homogeneizadas, distribuídas em garrafas plásticas limpas e não
estéreis de 2L de capacidade e congeladas à temperatura de -20°C no Núcleo de Pesquisas em
Ciências Ambientais (NPCIAMB) da Universidade Católica de Pernambuco.
3.2.2. Ensaios de Flotação
O soro de queijo foi submetido a ensaios de flotação, sendo utilizada uma coluna em
escala de bancada, projetada e construída em vidro e acrílico. Os experimentos foram realizados
em batelada de acordo com VILAR (2009), utilizando uma vazão de ar de 1.362 mL/min na
BELO, M.O.M. Degradação hidrolítica dos concentrados obtidos pelo processo de ...
49
condição de pH do efluente (pH 5,0). O material flotado obtido foi congelado para sua posterior
utilização nos ensaios de hidrólise.
3.2.3. Obtenção do consórcio microbiano
O consórcio microbiano foi obtido a partir de cultivo do efluente em biorreator de 2L de
capacidade e 1,5L de volume útil, operando sob agitação mecânica de 200rpm, aeração de 1vvm
e temperatura de 28 - 30
o
C. Os cultivos foram realizados em duplicata.
Cada reator permaneceu em funcionamento durante onze dias, sendo realizado um pulso
corresponde a 10% (v/v) do volume do biorreator no sétimo dia de experimento. Foram retiradas
amostras em duplicata de aproximadamente 10mL, sendo armazenadas em freezers para
posterior análise da atividade lipásica.
3.2.4. Tratamento enzimático do flotado
Inicialmente foi realizado um planejamento experimental de duas variáveis (agitação e
concentração de enzima) a dois níveis, com ensaios em triplicata no ponto central. A Tabela 3.1
mostra o planejamento experimental utilizado e os níveis das variáveis investigados.
Tabela 3.1 – Primeiro planejamento experimental utilizado nos ensaios de hidrólise
Experimentos
Nível da
agitação
Agitação
(rpm)
Nível da
concentração
de enzima
Concentração
de enzima*
(%)
1 - 1
0
- 1
1
2 - 1
0
+1
7
3 +1
200
- 1
1
4 +1
200
+1
7
5 0
100
0
4
6 0
100
0
4
7 0
100
0
4
Lipolase® (100T, Novozymes®)
Um segundo planejamento experimental foi realizado após seleção da condição de
agitação a partir dos experimentos anteriores (150rpm). As condições experimentais são
mostradas na Tabela 3.2.
BELO, M.O.M. Degradação hidrolítica dos concentrados obtidos pelo processo de ...
50
Tabela 3.2 – Segundo planejamento experimental utilizado nos ensaios de hidrólise
Experimentos
Nível da
concentração
de enzima
Concentração
de enzima*
(%)
Nível da
concentração
de consórcio
Concentração
de consórcio
(%)
1 - 1
1
- 1
3
2 - 1
1
+1
6
3 +1
4
- 1
3
4 +1
4
+1
6
5 0
2,5
0
4,5
6 0
2,5
0
4,5
7 0
2,5
0
4,5
*Lipolase® (100T, Novozymes®)
Para a realização dos experimentos, uma quantidade de 2g do flotado foi transferida para
Erlenmeyers de 250mL de capacidade, adicionando-se posteriormente um volume de 150mL de
solução tampão Tris-HCl (pH 8,0). Os ensaios foram realizados por 48 horas e a cinética da
hidrólise foi acompanhada pela dosagem do pH, concentração de ácidos graxos e atividade
lipolítica. Os experimentos foram realizados a 30
o
C.
Os resultados foram avaliados utilizando-se o software Statistica® versão 6.0. Cabe
ressaltar que os experimentos foram realizados randomicamente e o erro experimental do
planejamento foi obtido através da média e desvio padrão dos pontos centrais que foram
repetidos.
A avaliação estatística foi realizada investigando-se os resultados experimentais com ou
sem efeitos de interação entre as variáveis, sendo considerados os melhores ajustes para os
modelos empíricos propostos.
3.2.5. Determinações analíticas
- pH
:
A variação do pH no meio reacional foi determinada por potenciometria, utilizando-se um
pHmetro digital (ORION, modelo 20A).
- Atividade lipolítica
:
Foi avaliada de acordo com a metodologia descrita por Vorderwulbecke, Kieslich,
Erdmann (1992), utilizando o lipídeo paranitrofenilpalmitato (pNPP) que, por hidrólise, produz
BELO, M.O.M. Degradação hidrolítica dos concentrados obtidos pelo processo de ...
51
ácido palmítico e um derivado de coloração amarela. Este é espectrofotometricamente
determinado avaliando-se a coloração formada por unidade de tempo. As velocidades máximas
das reações enzimáticas foram calculadas em função das leituras de absorbâncias medidas a
410nm, sendo determinadas as atividades lipolíticas utilizando-se o coeficiente de absorção
molar do pNPP (15 mmol
-1
.cm
-1
). As medidas foram realizadas a cada 2 minutos em
espectrofotômetro (Libra S32-Biochrom), por um total de 10min. A Unidade Internacional (UI) de
atividade enzimática é definida como a quantidade de enzima que catalisa 1µmol de substrato por
minuto nas condições da reação (pH 8,0; 30
o
C). As análises foram realizadas em triplicata.
- Caracterização do material flotado
:
A concentração de óleos e graxas foi determinada por extração em Soxhlet, utilizando éter
de petróleo como solvente, de acordo com o procedimento padrão descrito pela APHA (1992). O
teor de óleos e graxas foi calculado através da Equação 3.1:
3
12
M
(mL) extraída amostra da Volume
1000)M(M
) (mg/L graxas e Óleos −
×
−
=
(3.1)
onde:
M
1
= Peso do balão vazio (mg)
M
2
= Peso do balão com resíduo de óleos e graxas (mg)
M
3
= Valor da prova em branco (mg/L)
- Dosagem de ácidos graxos
:
Parte 1 – Transesterificação das amostras
Inicialmente, as amostras foram submetidas a uma reação de transesterificação, que
consiste numa reação química dos óleos ou gorduras com um álcool (metanol ou etanol), na
presença de um catalisador (Figura 3.1).
Figura 3.1 – Reação de transesterificação de triglicerídeos
BELO, M.O.M. Degradação hidrolítica dos concentrados obtidos pelo processo de ...
52
A transesterificação das amostras foi realizada de acordo com a metodologia descrita por
HARTMAN e LAGO (1973). Inicialmente, era preparado o reagente de transesterificação por meio
de refluxo de uma mistura contendo 2g de cloreto de amônio (NH
4
Cl), 60mL de metanol (CH
3
OH)
e 3 ml de ácido sulfúrico (H
2
SO
4
) concentrado por 15 minutos. Em seguida, 0,5g da amostra era
colocada num balão de 250mL, adicionando-se 5mL de solução de NaOH 0,5N em metanol. A
mistura era submetida a refluxo por 5 minutos, quando era adicionada à solução ainda quente um
volume de 15mL do reagente de transesterificação, deixando-se a mistura reacional em refluxo
por mais 3 minutos.
A amostra era então resfriada e transferida para um funil de separação, adicionando-se
5mL de hexano e 10 mL de água saturada com cloreto de sódio. A mistura era agitada
vigorosamente por alguns segundos e colocada em repouso para separação completa das duas
fases. Após remoção da fase inferior (água, cloreto de sódio, excesso de álcool, glicerol e
hidróxido de sódio), o balão era lavado com outra porção de 10mL de água saturada com cloreto
de sódio. O material (mistura de ésteres metílicos dos ácidos graxos constituintes da amostra)
era então transferido para frascos de penicilina, sendo adicionado sulfato de sódio anidro para
remoção de toda umidade. Os frascos eram devidamente lacrados e conservados sob
refrigeração (4
o
C) até a realização da análise cromatográfica.
Parte 2 – Análise cromatográfica
Foi utilizado um cromatógrafo a gás (marca MASTER CG) dotado de detector de
ionização de chama, empregando-se uma coluna capilar (Zebron ZB-5) de sílica fundida
contendo um filme com 0,25
µm de polietilenoglicol (Carbowax 20M) de dimensões 30m x
0,25mm x 1
µm. A temperatura do detector foi de 250
o
C, a temperatura do vaporizador foi de
200
o
C, e o forno foi programado de acordo com as seguintes condições: 50
o
C durante 5 minutos;
5
o
C/min até 110
o
C, permanecendo por 4 minutos, e 4
o
C/min até 150
o
C, permanecendo por 5
minutos.
Foram utilizados como padrões amostras de concentrações conhecidas dos ácidos
hexanóico, láurico, mirístico, palmítico, heptadecanóico e linoléico. Inicialmente era determinado
o fator (f) referente a cada análise dos padrões de acordo com a Equação 3.2:
A
C
f =
(3.2)
BELO, M.O.M. Degradação hidrolítica dos concentrados obtidos pelo processo de ...
53
onde C é uma concentração conhecida da amostra-padrão (g/L) e A é a área dada pelo
cromatograma. Em seguida, conhecendo-se as áreas dos cromatogramas para as amostras, o
fator f era então utilizado para o cálculo das concentrações dos ácidos graxos não hidrolisados.
A quantificação dos ácidos graxos presentes no material flotado também foi avaliada de
acordo com a metodologia acima descrita. Dessa forma, os ácidos graxos liberados durante a
hidrólise (ácidos graxos livres-AGL) foram determinados de maneira indireta, utilizando-se a
Equação 3.3:
AGL = AGF – AGT
(3.3)
onde:
AGF - ácidos graxos do flotado (g/L)
AGT - ácidos graxos dos triglicerídeos (não hidrolisados) (g/L)
3.3. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Foi obtido um teor de 63,3% de óleos e graxas no material flotado. A Tabela 3.3 ilustra os
resultados para as concentrações dos ácidos graxos presentes no material flotado. Pode ser
observado que foi obtida uma concentração total de ácidos graxos equivalente a 13,36g/L, e que
o ácido palmítico é o que está presente em maior concentração (9,59g/L). Estes resultados
corroboram com os encontrados por Mendes et al. (2006), que observaram concentrações de
ácidos graxos de cadeia longa em um efluente lácteo correspondentes a 39,2% para o palmítico,
seguido do oléico (21,2%), esteárico (16,8%) e mirístico (13,9%). Os autores salientam ainda que
as elevadas concentrações de ácidos graxos de cadeia longa no efluente em estudo ocorrem
devido também à utilização de detergentes nas etapas de lavagem de pisos e tubulações.
Tabela 3.3 – Concentrações dos ácidos graxos presentes no material flotado
Ácido graxo Concentração (g/L)
Hexanóico 0,48
Láurico 0,46
Mirístico 1,76
Palmítico 9,59
Heptadecanóico 0,33
Linoléico 0,74
BELO, M.O.M. Degradação hidrolítica dos concentrados obtidos pelo processo de ...
54
A Figura 3.2 mostra um cromatograma típico obtido na análise de ácidos graxos.
C6: Hexanóico C5H11COOH; C12: Láurico C
11
H
23
COOH; C14: Mirístico C
13
H
27
COOH; C16: Palmítico
C
15
H
31
COOH; C17: Heptadecanóico C
16
H
33
COOH; C18:2: Linoléico C
17
H
31
COOH
Figura 3.2 – Cromatograma típico da análise de ácidos graxos (Condições: coluna capilar de
sílica fundida de dimensões 30m x 0,25mm x 1
µm, temperatura do detector de 250
o
C;
temperatura do vaporizador de 200
o
C; programação do formo: 50
o
C por 5min; 5
o
C/min até 110
o
C,
permanecendo por 4 minutos, e 4
o
C/min até 150
o
C, permanecendo por 5 minutos)
No primeiro planejamento fatorial, verificou-se a influência das duas variáveis de entrada
(concentração de enzima e agitação) sobre os valores das variáveis resposta (pH, concentração
de ácidos graxos livres e atividade lipásica) do processo.
A Figura 3.3 apresenta a superfície de resposta e a curva de contorno para o percentual
de liberação de ácidos graxos em função da concentração de enzima e da agitação para um
tempo de hidrólise de 4 horas. Os resultados mostram que foram obtidos percentuais de
liberação de ácidos graxos próximos a 100% para valores intermediários de agitação (entre 100 e
150rpm) e em maiores concentrações de enzima.
O diagrama de Pareto (Figura 3.4-A), que apresenta de forma clara os efeitos que são
estatisticamente importantes, mostra que o termo quadrático da agitação e o termo linear da
concentração de enzima são significativos. A Figura 3.4-B apresenta os resultados experimentais
BELO, M.O.M. Degradação hidrolítica dos concentrados obtidos pelo processo de ...
55
versus os resultados previstos pelo modelo ajustado, mostrando uma boa concordância entre
eles.
Para a variável resposta pH, considerando o mesmo tempo de hidrólise, o menor valor
observado foi de 6,8 no mesmo intervalo de agitação e também em maiores concentrações de
enzima (Figura 3.5). Neste caso, os termos significativos do modelo são os termos linear e
quadrático da agitação (Figura 3.6-A), enquanto que pode ser observada uma boa concordância
entre os resultados experimentais e os previstos pelo modelo ajustado (Figura 3.6-B).
O maior valor de atividade lipásica observado após 4 horas de hidrólise foi equivalente a
80UI/mL, como mostra a Figura 3.7. Como era esperado, esta condição foi atingida para as
maiores concentrações de lipase e, em concordância com os resultados anteriores, nos valores
intermediários de agitação. De acordo com a Figura 3.8, observa-se que a lipase e a agitação
apresentam efeito positivo significativo (p<0,05), sendo obtida uma boa concordância entre os
resultados experimentais e os previstos pelo modelo ajustado.
As Equações 3.4, 3.5 e 3.6 representam os modelos empíricos ajustados para o
percentual de liberação de ácidos graxos, pH e atividade lipásica, respectivamente, para um
tempo de hidrólise de 4 horas, e suas respectivas variâncias explicadas. Os parâmetros em
negrito são os estatisticamente significativos ao nível de 95% de confiança. A variável z
representa o percentual de liberação de ácidos graxos na Equação 3.4, o pH na Equação 3.5 e a
atividade lipásica na Equação 3.6, enquanto que as variáveis x e y expressam a agitação e a
concentração de lipase, respectivamente.
BELO, M.O.M. Degradação hidrolítica dos concentrados obtidos pelo processo de ...
56
(A)
-20 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220
Agitação (rpm)
0
1
2
3
4
5
6
7
8
Enzima (%)
100
98
96
94
(B)
Figura 3.3 – Superfície de resposta (A) e curva de contorno (B) para o percentual de
liberação de ácidos graxos como função da concentração de enzima e da agitação (tempo
de hidrólise de 4 horas; 95% de significância; teor inicial de ácidos graxos de 13,36g/L
BELO, M.O.M. Degradação hidrolítica dos concentrados obtidos pelo processo de ...
57
-1,55885
3,810512
7,274613
7,89945
7
p=,05
Efeito estimado (valor absoluto)
1Lby2L
(1)Agitação (rpm)(L)
(2)Enzima (%)(L)
Agitação (rpm)(Q)
(A)
93 94 95 96 97 98 99 100 101
Valores observados
93
94
95
96
97
98
99
100
Valores preditos
(B)
Figura 3.4 – Diagrama de Pareto (A) e valores preditos versus valores observados (B) para
o percentual de liberação de ácidos graxos como função da concentração de enzima e da
agitação (tempo de hidrólise de 4 horas; 95% de significância; teor inicial de ácidos graxos
de 13,36g/L)
BELO, M.O.M. Degradação hidrolítica dos concentrados obtidos pelo processo de ...
58
(A)
-20 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220
Agitação (rpm)
0
1
2
3
4
5
6
7
8
Enzima (%)
8
7,8
7,6
7,4
7,2
7
6,8
(B)
Figura 3.5 – Superfície de resposta (A) e curva de contorno (B) para o pH como função da
concentração de enzima e da agitação (tempo de hidrólise de 4 horas; 95% de significância)
BELO, M.O.M. Degradação hidrolítica dos concentrados obtidos pelo processo de ...
59
-3,04997
-3,65997
-9,9124
1
-10,08
3
p=,05
Efeito estimado (valor absoluto)
1Lby2L
(2)Lipase (%)(L)
(
1)Agitação (rpm)(L)
Agitação (rpm)(Q)
(A)
6,8 6,9 7,0 7,1 7,2 7,3 7,4 7,5 7,6 7,7 7,8 7,9 8,0
Valores observados
6,8
6,9
7,0
7,1
7,2
7,3
7,4
7,5
7,6
7,7
7,8
7,9
8,0
Valores preditos
(B)
Figura 3.6 – Diagrama de Pareto (A) e valores preditos versus valores observados (B) para o pH
como função da concentração de enzima e da agitação
(tempo de hidrólise de 4 horas; 95% de significância)
BELO, M.O.M. Degradação hidrolítica dos concentrados obtidos pelo processo de ...
60
(A)
-20 0 20 40 60 80 100 120 140 160 180 200 220
Agitação (rpm)
0
1
2
3
4
5
6
7
8
Enzima (%)
80
60
40
20
0
(B)
Figura 3.7 – Superfície de resposta (A) e curva de contorno (B) para a atividade lipásica como
função da concentração de enzima e da agitação (tempo de hidrólise de 4 horas; 95% de
significância)
BELO, M.O.M. Degradação hidrolítica dos concentrados obtidos pelo processo de ...
61
,6739114
1,198065
10,60965
11,69841
p=,05
Efeito estimado (valor absoluto)
(1)Agitação (rpm)(L)
1Lby2L
Agitação (rpm)(Q)
(2)Lipase (%)(L)
(A)
0 1020304050607080
Valores observados
0
10
20
30
40
50
60
70
80
Predicted Values
(B)
Figura 3.8 – Diagrama de Pareto (A) e valores preditos versus valores observados (B) para a
atividade lipásica como função da concentração de enzima e da agitação (tempo de hidrólise de 4
horas; 95% de significância)
BELO, M.O.M. Degradação hidrolítica dos concentrados obtidos pelo processo de ...
62
z = 93,0763 + 0,0649*x - 0,0003*x^2 + 0,6362*y - 0,0011*x*y; R
2
= 0,9851 (3.4)
z = 7,8467 - 0,0120*x + 0,00005*x^2 - 0,0067*y - 0,0003*x*y; R
2
= 0,9911 (3.5)
z = 10,6333 + 0,5467*x - 0,0028*x^2 + 6,0767*y + 0,0069*x*y; R
2
= 0,9921 (3.6)
Na Tabela 3.4 encontram-se os parâmetros das análises de variância (ANOVA)
(coeficiente de variação explicada - R
2
e teste F) para o ajuste dos modelos empíricos relatados
anteriormente. Observa-se que os modelos são estatisticamente significativos, pois os
coeficientes de variação explicada são satisfatórios e a razão de F
calculado
por F
tabelado
está acima
de 1, para um nível de confiança de 95% (BARROS NETO, SCARMÍNIO, BRUNS 2001).
Tabela 3.4 - Parâmetros da análise de variância para o percentual de liberação de ácidos graxos,
pH e atividade lipásica no primeiro planejamento experimental para um tempo de hidrólise de 4
horas.
Variável
resposta
Variáveis
significativas
Soma
quadrática
Graus de
liberdade
Média
quadrática
F
calculado
(95%)
F
tabelado
(95%)
R
2
Agitação
(termo
quadrático)
11,6536 1 11,6536 62,4014
Enzima
(termo linear)
9,8829 1 9,8829
52,9200
10,13
0,9851
Erro 0,3735 2 0,1867
Percentual
de
liberação
de ácidos
graxos
Total 25,0755
Agitação
(termo linear)
0,4225 1 0,4225 98,2558
Agitação
(termo
quadrático)
0,4372 1 0,4372 101,6711
10,13
0,9911
Erro 0,0086 2 0,004300
pH
Total 0,9659
Agitação
(termo
quadrático)
1357,152 1 1357,152 112,5648
Enzima
(termo linear)
1649,984 1 1649,984 136,8528
10,13
0,9921
Erro 24,113 2 12,057
Atividade
lipásica
Total 3054,031
A Figura 3.9 mostra a aparência das amostras antes e após a hidrólise, podendo ser
observada visualmente a completa dissolução do material flotado.
BELO, M.O.M. Degradação hidrolítica dos concentrados obtidos pelo processo de ...
63
(A) (B)
Figura 3.9 – Fotos do experimento de hidrólise. (A) antes da hidrólise e (B) após 48h de hidrólise
Os resultados obtidos no presente trabalho indicam que, na faixa de concentração de
enzima testada (1 a 7%), foram observados percentuais de liberação de ácidos graxos superiores
a 92% em apenas 4 horas de hidrólise. Pereira et al. (2002), quando investigaram a remoção de
carga lipolítica de um efluente industrial gerado em frigorífico de abate de frango utilizando
lipases microbianas comerciais (Candida rugosa e Lipolase), observaram que a lipolase
apresentou maior velocidade de reação em 4 horas, enquanto que a lipase de Candida rugosa
necessitou de 6 horas para alcançar 100% de taxa de hidrólise.
Com o objetivo de avaliar a utilização de um consórcio microbiano obtido a partir do
cultivo no próprio efluente, sobre a hidrólise do material flotado, um novo planejamento
experimental foi realizado. Foram investigadas as variáveis concentração de enzima comercial e
concentração de consórcio sobre as variáveis resposta anteriormente descritas.
As amostras do consórcio selecionadas foram as que obtiveram uma maior atividade
lipásica durante o cultivo do efluente em biorreator. Dessa forma, foram utilizadas as amostras
correspondentes ao primeiro e terceiro dia do cultivo B (dados mostrados na Figura 2.5 do
capítulo 2).
A Figura 3.10 mostra a superfície de resposta (A) e a curva de contorno (B) para o
percentual de liberação de ácidos graxos após 4 horas de hidrólise. Valores próximos a 100% de
liberação de ácidos graxos foram atingidos para todas as concentrações de enzima testadas.
Neste caso, maiores concentrações de consórcio não promoveram um incremento na
concentração de ácidos graxos livres.
O Diagrama de Pareto (Figura 3.11-A) mostra que ambas as variáveis foram significativas
a um nível de confiança de 95%, inclusive o fator de interação linear entre as mesmas. Os dados
de ajuste do modelo empírico proposto mostram-se bem ajustados, como ilustra a Figura 3.11-B.
BELO, M.O.M. Degradação hidrolítica dos concentrados obtidos pelo processo de ...
64
(A)
0,5 1,0 1,5 2,0 2,5 3,0 3,5 4,0 4,5
Enzima (%)
2,5
3,0
3,5
4,0
4,5
5,0
5,5
6,0
6,5
Consórcio (%)
100
90
80
70
60
(B)
Figura 3.10 – Superfície de resposta (A) e curva de contorno (B) para o percentual de liberação
de ácidos graxos como função da concentração de enzima e da concentração de consórcio
(tempo de hidrólise de 4 horas; 95% de significância; teor inicial de ácidos graxos de 13,36g/L)
BELO, M.O.M. Degradação hidrolítica dos concentrados obtidos pelo processo de ...
65
70,10074
78,75049
87,94292
-98,68
4
p=,05
Efeito estimado (valor absoluto)
enzima (%)(Q)
(1)enzima (%)(L)
1Lby2L
(2)consórcio (%)(L)
(A)
65 70 75 80 85 90 95 100 105
Valores observados
65
70
75
80
85
90
95
100
105
Valores preditos
(B)
Figura 3.11 – Diagrama de Pareto (A) e valores preditos versus valores observados (B) para o
percentual de liberação de ácidos graxos como função da concentração de enzima e da
concentração de consórcio (tempo de hidrólise de 4 horas; 95% de significância; teor inicial de
ácidos graxos de 13,36g/L)
BELO, M.O.M. Degradação hidrolítica dos concentrados obtidos pelo processo de ...
66
Para as variáveis resposta pH e atividade lipásica, a análise estatística realizada,
considerando ou não os possíveis efeitos de interação, demonstrou que não houve significância
para um nível de confiança de 95% para qualquer das variáveis testadas dentro da faixa
estudada no planejamento de experimentos.
A Equação 3.7 mostra o modelo empírico ajustado para o percentual de liberação de
ácidos graxos no tempo de hidrólise de 4 horas, e sua respectiva variância explicada. Os
parâmetros em negrito são os estatisticamente significativos ao nível de 95% de confiança. A
variável z representa o percentual de liberação de ácidos graxos, enquanto que as variáveis x e y
expressam a concentração de lipase e a concentração de consórcio, respectivamente.
z = 123,0745 + 8,9259*x -3,7077*x^2 -12,7380*y + 3,0450*x*y; R
2
= 0,9999 (3.7)
Na Tabela 3.5 encontram-se os parâmetros das análises de variância (ANOVA)
(coeficiente de variação explicada - R
2
e teste F) para o ajuste do modelo empírico. Observa-se
que o modelo é estatisticamente significativo, com um coeficiente de variação explicada muito
satisfatório (0,9999) e uma razão de F
calculado
por F
tabelado
acima de 1, para um nível de confiança
de 95%.
Tabela 3.5 - Parâmetros da análise de variância para o percentual de liberação de ácidos graxos
no segundo planejamento experimental para um tempo de hidrólise de 4 horas.
Variável
resposta
Variáveis
significativas
Soma
quadrática
Graus de
liberdade
Média
quadrática
F
calculado
(95%)
F
tabelado
(95%)
R
2
Enzima
(termo linear)
150,5621 1 150,5621 6201,640
Enzima
(termo
quadrático)
119,3038 1 119,3038 4914,114
Consórcio
(termo linear)
236,4302 1 236,4302 9738,537
Interação
enzima e
consórcio
187,7634 1 187,7634 7733,957
10,13
0,9999
Erro 0,0486 2 0,0243
Percentual
de
liberação
de ácidos
graxos
Total 694,1081 6
Podemos observar que a adição do consórcio microbiano não influenciou de maneira
positiva para o aumento do teor de ácidos graxos livres no meio. No entanto, o modelo empírico
mostra que há um forte efeito de interação entre as variáveis enzima e consórcio microbiano. Os
resultados sugerem que concentrações menores de enzima podem ser empregadas para o
tratamento hidrolítico do material flotado.
BELO, M.O.M. Degradação hidrolítica dos concentrados obtidos pelo processo de ...
67
3.4. CONCLUSÕES
Em todos os experimentos utilizando apenas a enzima lipase, observou-se que houve a
liberação de ácidos graxos no meio em percentuais próximos a 100% apenas após 4 horas de
reação em maiores concentrações de enzima considerando a faixa de concentração investigada
(1 a 7%) e para níveis de agitação entre 100 e 150rpm. O emprego da enzima associada a um
consórcio microbiano obtido a partir do próprio efluente poderia vir a viabilizar economicamente o
processo. No entanto, testes de hidrólise demonstraram que a adição do consórcio microbiano
não influenciou de maneira positiva para o aumento do teor de ácidos graxos livres no meio.
Ensaios adicionais são ainda necessários para avaliar o efeito da adição da enzima em menores
concentrações sobre a hidrólise do material flotado de efluente de laticínios.
Agradecimentos
Os autores agradecem ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e
Tecnológico – CNPq, pelo apoio financeiro (número de processo 485292/2006-8), a Coordenação
de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior – CAPES, pela concessão de bolsa de
mestrado, à empresa Laticínios São Bento, pela doação do soro de leite. Os autores agradecem
ainda ao professor Alexandre Schuler, pelo auxílio na realização das análises cromatográficas.
3.5. REFERÊNCIAS
APHA - AMERICAN PUBLIC HEALTH ASSOCIATION, (1992), Standard Methods for Water and
Wastewater, 18th ed., APHA.
BARROS NETO, B.; SCARMÍNIO, J.S.; BRUNS, R.E. Como fazer experimentos. Editora
Unicamp, Campinas, São Paulo, 401p., 2001.
HARTMAN, L., LAGO, R.C. A . Rapid preparation of fatty acid methyl ester from lipids. Londres:
Laboratory Practices., v. 22, p. 475-476, 1973.
KITCHENER, J. A., The froth flotation process: Past, present and future-in brief. In: The Scientific
Basis of Flotation, Part 1. NATO Advances Study Institute, pp. 1-26, 1985
BELO, M.O.M. Degradação hidrolítica dos concentrados obtidos pelo processo de ...
68
LEAL, M. C. M. R.; FREIRE, D. M. G.; CAMMAROTA, M. C.; SANT´ANNA Jr, G. L.; Effect of
enzymatic hydrolysis on anaerobic treatment of diary wastewater - Process Biochemistry, v.46,
pp. 1173-1178, 2006.
LUNA, C. L.; Avaliação de técnicas de separação fluido-sólido na produção de
bioinseticidas a partir de Bacillus sphaericus e Bacillus thuringiensis var. israelensis, Tese
de Doutorado, Universidade Federal do Rio de Janeiro, Brasil, 2004.
MASSE, L.; KENNEDY, K.J.; CHOU, S., Testing of alkaline and enzymatic hydrolysis
pretreatments for fat particles in slaughterhouse wastewater. Bioresource Technology, v.77, pp.
145-155, 2001.
MENDES, A.A.; PEREIRA, E.B.; CASTRO, H.F. Biodegradação de águas residuárias de laticínios
previamente tratadas por lipases. Brazilian Journal of Food Technology, v.9, pp. 143-149,
2006.
MONGKOLTHANARUK, W.; DHARMISTHITI, S., Biodegradation of lipid-rich wastewater by
mixed bacterial consortium - International Biodeterioration & Biodegradation, v.50, pp.101-
105, 2002.
PEREIRA, E.B.; TEIXEIRA, R.M.; DE CASTRO, H.F., FURIGO Jr., A., Tratamento enzimático
utilizando lipases em rejeitos industriais frigoríficos, XIV Congresso Brasileiro de Engenharia
Química-COBEQ, Natal, RN, 2002.
RIGONI, R. E.; RIGO, E.; FREIRE, D. M. G.; OLIVEIRA, D.; Di LUCCIO, M.; Utilização de lipase
como auxiliar na degradação de gordura do flotado de indústria de carnes, XIV Simpósio Nacional
de Fermentações, Florianópolis, 2003.
VILAR, A.C., Utilização da flotação em coluna para o tratamento de efluente da indústria
láctea, Dissertação de mestrado, Universidade Católica de Pernambuco, Brasil, 2009.
VORDERWULBECKE, T.; KIESLICH, K.; ERDMANN, H. Comparison of lipases by different
assays. Enzyme Micro. Technol., v. 14, pp. 631-639, 1992.
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