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CENTRO UNIVERSITÁRIO NILTON LINS
CURSO DE PÓS – GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA URBANA
ÁREA DE CONCENTRAÇÃO: BIOLOGIA MOLECULAR
DEGRADAÇÃO AMBIENTAL POR CHORUME NA ÁREA URBANA DA
CIDADE DE MANAUS (AM): O USO DE EXPRESSÃO GÊNICA DIFERENCIAL
EM PEIXES PARA A DETERMINAÇÃO DE MARCADORES.
ALEXANDRE TARGINO DA SOLEDADE
Manaus - Amazonas
2008
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ALEXANDRE TARGINO DA SOLEDADE
DEGRADAÇÃO AMBIENTAL POR CHORUME NA ÁREA
URBANA DA CIDADE DE MANAUS (AM): O USO DE
EXPRESSÃO GÊNICA DIFERENCIAL EM PEIXES PARA
A DETERMINAÇÃO DE MARCADORES.
Orientadora: Profª. Mônica Stropa Ferreira Nozawa, Doutora.
Dissertação apresentada ao curso de Pós-
Graduação em Biologia Urbana: Mestrado
Acadêmico em Biologia Urbana, do Centro
Universitário Nilton Lins - CUNL, como parte
dos requisitos para a obtenção do titulo de
mestre
.
Manaus - Amazonas
2008
2
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Alexandre Targino da Soledade
DEGRADAÇÃO AMBIENTAL POR CHORUME NA ÁREA
URBANA DA CIDADE DE MANAUS (AM): O USO DE
EXPRESSÃO GÊNICA DIFERENCIAL EM PEIXES PARA
A DETERMINAÇÃO DE MARCADORES.
Esta Dissertação foi julgada adequada para a obtenção do título de Mestre em
Biologia Urbana (Mestrado acadêmico em Biologia Urbana) e aprovada em sua
forma final pelo Curso de Pós-Graduação do Centro Universitário Nilton Lins.
Manaus, 30 de Julho de 2008.
_______________________________
Prof. Rubens Tomio Honda. Dr.
Coordenador do Curso de Pós-Graduação
em Biologia Urbana
Apresentada à Comissão Examinadora integrada pelos professores:
________________________________________
Profª. Mônica Stropa Nozawa, Dra. Orientadora.
________________________________________
Prof. Paulo Henrique Rocha Aride, Dr.
________________________________________
Prof. Carlos Gustavo Nunes da Silva, Dr.
3
Degradação ambiental por chorume na área urbana da cidade de Manaus
(AM): o uso de expressão gênica diferencial em peixes para a
determinação de marcadores.
Mônica S. Ferreira NOZAWA
2
, Alexandre Targino da SOLEDADE
1
RESUMO:
A exploração dos meios naturais é crescente e oferece riscos ao equilíbrio dos
ecossistemas, são cada vez maiores as pressões impostas aos peixes em seus
ambientes naturais e artificiais. A sobre pesca de espécies de interesse
comercial e o uso cada vez maior do ambiente aquático como meio de
transporte e veículo de descarte de efluentes agro-industriais e domésticos,
aumentam o risco de fragmentação das populações naturais de peixes e
provocam uma grande preocupação com a qualidade do pescado utilizado como
alimento. A qualidade do ambiente também começa a preocupar em função do
aumento da atividade de aqüicultura, que está sendo direcionada a um aumento
na densidade de animais estocados, bem como à implementação de métodos de
criação consorciados que aumentam a produção de proteína, mas podem piorar
a qualidade do ambiente de criação. Os peixes mostram uma grande variedade
de respostas fisiológicas a agentes estressantes no ambiente. Variações nessas
respostas podem ser atribuídas a diferentes espécies e linhagens, e refletem a
história evolutiva dos grupos e os ambientes nos quais estão aclimatizados. O
presente trabalho buscou o estabelecimento dos marcadores moleculares para o
monitoramento ambiental por meio da análise de expressão gênica diferencial e
de parâmetros bioquímicos, biologia molecular e de genotoxicidade em peixes
de importância para a recuperação de ambientes sob risco antrópico e para a
pisicultura, a partir de experimentos sob condições controladas.
PALAVRAS-CHAVES:
1. Tambaqui (Colossoma macropomum) 2. Chorume 3. Expressão gênica 4.Marcadores
moleculares
4
INTRODUÇÃO
Na Amazônia Ocidental, a cidade de Manaus apresentou nos últimos 25
anos um rápido crescimento populacional. Desde o inicio da década de 1950 até
a implantação da Zona Franca de Manaus em 1967, a população de 200 mil
habitantes se manteve relativamente inalterada, contando atualmente com uma
população de 1.800.000 habitantes, demonstrando assim, o processo acelerado
de crescimento populacional. O êxodo rural e os fluxos migratórios do Nordeste
e Sul do país foram motivados pela busca de melhores condições econômicas.
Por outro lado, os serviços de infra-estrutura urbana, não cresceram em
proporção suficiente para suprir a demanda, gerando sérios problemas
socioeconômicos e ambientais, especialmente nas áreas de saneamento e
saúde pública
1
.
A Amazônia é uma fonte expressiva de recursos genéticos com potencial
de uso por processos biotecnológicos. Ela tem uma biodiversidade bastante
expressiva, com espécies ainda desconhecidas, embora possam estar sendo
utilizadas pelas etnias e povos que aqui se instalaram, e que, realmente,
conhecem a sua utilização, mas sob a forma de processos primitivos ou
artesanais.
Além das espécies de plantas e animais, existe uma microbiota muito
expressiva e da maior importância para a Amazônia, para o País e para a
humanidade, como é o caso de microrganismos que saíram da Amazônia, foram
para a Europa e voltaram para melhorar processos de produção de celulose.
5
A aqüicultura, por seu crescente aporte na produção mundial de pescado,
surge como alternativa para aumentar a produção de alimentos
2
. prevê que no
próximo século haverá um aumento na demanda de pescado nos países em
desenvolvimento, por ser uma alternativa alimentar de alto valor nutritivo, possuir
relativamente baixos teores de gordura e alta digestibilidade
2.
Fortes evidências
demonstram que as espécies exploram hábitats específicos, determinando
padrões de distribuição característicos conforme as condições necessárias
3,4
.
Desta forma, alterações nas condições ambientais promovem uma
reestruturação das assembléias ícticas, refletindo as condições vigentes da
bacia hidrográfica em que estão inseridas
5,6
.
Atualmente, a rápida expansão radial dos centros urbanos tem tido como
conseqüência a degradação de habitats, com reflexos sobre os recursos
naturais e nos ecossistemas aquáticos
7
. Embora a intensidade e duração de
determinados fatores abióticos oscilem consideravelmente na natureza, ações
antropogênicas têm geralmente amplificado seus efeitos, criando condições
antes nunca encontradas pelas assembléias de peixes
4
.
Alguns são os estudos que avaliam as respostas das espécies de peixes
à urbanização, onde estes estudos explicam a compreensão de processos
relevantes
8,9
.
A falta de conhecimento, por outro lado dificulta severamente o
desenvolvimento de estratégias de manejo integradas, mitigação de impactos e
políticas de conservação
6
. Estas condições alem do desequilíbrio ambiental
(fauna e flora) levam a formação de ambientes propícios ao desenvolvimento de
6
doenças de veiculação hídrica, com reflexos ao aumento da demanda dos
serviços sanitários e de saude
10
.
No Brasil, em alguns casos o chorume é coletado nos aterros sanitários e
transportado, em caminhões pipa, para estações de tratamento de esgotos
(ETEs), onde é submetido à degradação microbiológica. Após isso, o chorume é
lançado, juntamente com o esgoto tratado em águas superficiais. Uma vez que é
desconhecida a identidade dos compostos presentes no chorume, não há como
prever se este tratamento é efetivo
11
.
A bacia da Amazônia é caracterizada por uma complexa rede de rios,
lagos, paránas (canal), igarapés (pequenos rios de água preta), praias, várzeas
(áreas de inundação de água branca) e igapós (áreas de inundação de água
preta) que de certa forma mantém forte relação com o fluxo de cheia e
vazante
12
.
De maneira complementar a biblioteca de cDNA passa a ser abordagem
interessante quando o objetivo é selecionar apenas os genes que estão sendo
expressos em determinados organismos. Esta expressão pode ser direcionada
de maneira tecido ou temporalmente especifica. Sendo assim, para aumentar a
representação de determinado gene, a biblioteca a ser estudada pode ser feita a
partir de mRNA de células que expressão o gene de interesse em altos níveis
15,16
.
A identificação de genes diferencialmente expressos tem sido usada
como uma importante abordagem experimental para conhecer não somente a
7
função gênica, mais também pra compreender como os mecanismos
moleculares estão relacionados com os processos biológicos
14
.
Para o isolamento de genes diferencialmente expressos em um dado
sistema biológico, é importante assegurar que todas as espécies de mRNA
estejam representados na biblioteca de cDNA, tanto as raras como as
abundantes
14.
Particularmente, a tecnologia de PCR tem sido amplamente aplicada na
identificação de marcadores de DNA úteis na aqüicultura e na conservação de
estoques naturais de espécies de peixes. Marcadores genéticos aplicados à
produção de peixes em cultivo e marcadores morfogéneticos, geralmente
associados a caracteres fenotípicos, e marcadores enzimáticos ou bioquímicos,
associados às múltiplas formas moleculares de proteínas, representaram as
abordagens iniciais que foram usadas para analisar características que refletem
a composição genética de estoques de peixes. A simplicidade e o baixo custo da
analise de eletroforese fizeram com que essa ferramenta fosse amplamente
utilizada para a caracterização genética de espécies, populações e/ou estoques
de peixes
17.
Da mesma forma, marcadores cromossômicos têm sido também
utilizados com grande sucesso em estudos de populações naturais, assim como
no manejo de estoques em cultivo. Os progressos no melhoramento genético de
peixes cultivados têm sido focos de discussões e revisões durante a ultima
década
18.
8
De modo resumido, o procedimento para a síntese, clonagem e isolamento de
cDNAs específicos envolve 4 etapas:
• Síntese in vitro de cDNAs de fita dupla a partir de RNAs mensageiros
isolados do tecido de interesse;
• Preparo dos cDNAs para a ligação com o vetor escolhido;
• Introdução dos cDNA recombinantes nas células hospedeiros, onde serão
replicados. Isto resultará na amplificação dos recombinantes e
dependendo do vetor utilizado, na expressão das proteínas codificadas
pelas mensagens que deram origem aos cDNAs.
• Identificação dos clones de interesse através de um processo de triagem
dos clones recombinantes.
JUSTIFICATIVA
Os resíduos sólidos urbanos gerados diariamente nas grandes cidades
são destinados na maioria das vezes a lixões a céu aberto ou aterros seja ele
controlado ou sanitário. Em ambas as formas de descarte ocorrem à produção
de contaminantes como o chorume. O chorume é o líquido produzido pela
massa orgânica do lixo durante o processo de degradação biológica. Este liquido
em contato com a água da chuva percola a massa do aterro, gera o lixiviado,
tóxico, tóxico chamado chorume
13,19
.
9
Após isso, o chorume é lançado, juntamente com o esgoto tratado em
águas superficiais. Uma vez que é desconhecida a identidade dos compostos
presentes no chorume, não há como prever se este tratamento é efetivo
11
.
No caso especial do aterro sanitário de Manaus, que está localizado no
Km 26 da AM-010 (Manaus-Itacoatiara), em uma área cercada de igarapés de
primeira e segunda ordem, o chorume produzido pode estar sendo percolado
para o lençol freático e/ou sendo canalizado aos igarapés, podendo estar
introduzindo uma quantidade elevada de metais. O aterro recebe resíduos
sólidos de uma população de aproximadamente 1,7 milhões de habitantes
12
.
Ao penetrar em um aqüífero, o chorume é submetido a um processo de
diluição, atenuando seus teores de contaminantes e formando uma pluma de
poluição, cuja extensão é determinada pelas características hidráulicas do
aqüífero, pela idade do deposito de lixo, pela densidade do chorume e pelas
irregularidades do substrato rochoso, porém a grande maioria das plumas tem
uma cauda de dispersão inferior a 1.000 metros.
38
Com relação às águas subterrâneas nas proximidades do aterro sanitário
de Manaus, atribui-se uma profundidade de contaminação em torno de 4m.
39
Na utilização do tambaqui (Colossoma macropomum Cuvier, 1818) como
modelo experimental, temos como uma das características para o estudo desta
espécie de peixe; o alto valor comercial que é de grande importância econômica
e social na América Latina. A espécie possui potencial para aqüicultura, pois se
adapta ao confinamento e arraçoamento.
35.
No entanto, a produção desta
10
espécie pela pesca comercial tem sofrido considerável diminuição em toda a
Amazônia em virtude do grande esforço de pesca investido.
36
É uma espécie com excelente potencial para cultivo por apresentar bom
crescimento, hábito gregário, resistência a baixos níveis de oxigênio dissolvido e
excelente utilização de alimentos
37
.
OBJETIVO GERAL:
Avaliar o efeito tóxico do chorume em juvenis de Tambaqui (Colossoma
macropomum), através de analise da expressão gênica diferencial, a partir de
experimentos controlados a fim de se estabelecer marcadores moleculares.
OBJETIVOS ESPECIFÍCOS:
• Iniciar os experimentos laboratoriais com diferentes concentrações de
chorume (concentração semelhante àquela encontrada nos igarapés e
suas concentrações amplificadas 10X, 100X e 1000X) em busca da
concentração ideal para os experimentos de expressão gênica.
• Selecionar e identificar genes por meio de expressão gênica diferencial
através da técnica de biblioteca subtrativa seguida de PCR.
• Seqüenciar e atribuir função aos genes selecionados através da busca de
similaridade de seqüência utilizando ferramentas de bioinformática e
bancos de dados públicos e construídos no próprio laboratório.
11
MATERIAL E MÉTODOS
Material biológico e locais de coleta
Os exemplares juvenis de tambaqui (Colossoma macroponum) utilizados
nos experimentos foram obtidos em fazendas de criação da região e
transportados para o Laboratório de Toxicologia Ambiental (CUNL), onde
passaram por tratamento profilático e aclimatação por duas semanas, antes do
inicio dos experimentos.
Modelo experimental
Foram utilizados exemplares de juvenis de tambaqui com comprimento
padrão em torno de 6 cm e 25-30g. O delineamento experimental foi distribuído
em dois tanques retangulares de fibra de vidro recobertos por tampas do mesmo
material de cor azul, capacidade para 500 l, constituindo-se em unidades de
alimentação. Os peixes foram distribuídos ao acaso, com densidade de vinte
indivíduos em cada tanque, localizados no interior de um laboratório fechado e
coberto. Os tanques foram abastecidos com água do sistema de abastecimento
da cidade de Manaus, com fluxos de entrada e saída de água controlada,
provida de aeração constante. Foram adotados sete dias como o período de
adaptação dos peixes às condições experimentais.
Os peixes foram mantidos nos tanques, sendo apenas retirados após
período de climatização, onde após esta etapa, foi realizado experimentos sob
12
condições controladas. Os experimentos de indução utilizando juvenis de
tambaqui foram realizados em três concentrações de chorume previamente
determinado.
A contaminação por chorume foi simulada da seguinte forma: Foram
expostos 6 animais a uma concentração de 2,06% de chorume em tanques
contendo 50 litros de água e aeração constante, e 6 peixes foram mantidos em
apenas água como controle. Após a etapa de exposição os animais foram
medidos e pesados e o fígado dos animais foi removido com o auxilio de bisturi
e de pinças cirúrgicas.
Para cada concentração de chorume 06 juvenis de tambaqui foram
expostos individualmente em aquários de 50 litros por um período de 96 horas,
ao poluente (chorume). Posteriormente foi extraído o RNA total de tecido do
fígado e/ou músculo, para posterior conversão em cDNA e construção das
bibliotecas subtrativas; realizou-se o seqüenciamento de DNA em larga escala e
comparamos os reads obtidos por meio de ferramentas de bioinformática com os
bancos de dados de peixes.
Extração de RNA total:
O RNA foi extraído utilizando-se o reagente de TRIZOL (Invitrogen Life
Technologies) a partir de 0,1-0,3mg de tecido muscular previamente congelado
a -80ºC, e seguindo ás recomendações do fabricante. O RNA total obtido foi
diluído em 40µl de água tratada com dietil pirocarbonato (DEPC) e a
13
concentração foi obtida com auxílio de espectrofotômetro UV-VIS duplo feixe.
Posteriormente foi realizado gel de agarose 1% para verificar a integridade do
RNA e a bandas serão visualizadas com auxilio de um transluminador UV.
Para a reação de RT-PCR será utilizado 1µg de RNA para um volume
total de 50µL de solução contendo tampão de reação, 5mM de MgCl2, 1mM de
DNTP mix, 1µM de primer, 10 unidades de inibidor de RNAse, 0,8 µL de AMV
transcriptase reversa e 10 ng de primer. A PCR foi realizada a partir de 2µL de
cDNA obtido na RT-PCR. A PCR foi obtida com auxilio de uma mistura contendo
25 unidades de Taq DNA polimerase em 20 mM Tris-HCI, KCI 100 mM, MgCl2 3
mM, dNTP 0.4 mM (dATP, dCTP, dGTP, dTTP), pH 8.3 (20°C) em um volume
final de 0.1 ml. O ciclo de PCR utilizado foi o seguinte: 30 ciclos: 94°C por 1
minuto; 50°C por 2 minutos, 72°C por 3 minutos e 70°C por 5 minutos. Num total
de 30 ciclos após re-amplificação, as amostras e os marcadores foram
visualizados em gel de agarose 1%.
Expressão gênica: construção da Biblioteca Subtrativa
Na busca de genes diferencialmente expressos, foi utilizada a técnica de
Biblioteca Subtrativa de cDNA (“Subtracted cDNA Library”). Resumidamente,
(figura 1), essa técnica permite a construção de clones de cDNA
correspondentes aos mRNAs presentes em células cultivadas em 2 condições
ambientais diferentes. Esta metodologia envolve pelo menos duas populações
de cDNA, uma das quais é utilizada como sonda e a outra como uma biblioteca,
14
na quais clones negativos foram selecionados em função de sinais de
hibridização DNA-DNA. Transcritos presentes em ambas as populações de
cDNA aparecem como positivos e genes expressos somente na população alvo,
como negativos
20, 22,23
.
Tester DNAc com adaptador 1R
(DNA submetido à ação de chorume)
Excesso de
driver
(sem chorume)
Tester DNAc com adaptador 2
R
Primeira hibridação
a
b
c
d
a
b
c
d
Segunda hibridação:
A, B,C,D+E
Preenchimento das extremidades
d
a,
d
-
não amplificam
b-
Hairpin
c-
amplificação linear
e-
amplificação exponencial
e
Molécula diferencialmente
expressa (Tipo E)
a
b
c
(cDNA submetido à ação de
chorume)
Figura 1: Esquema da Biblioteca Subtrativa de cDNA seguida de PCR (retirado
do protocolo da Clontech (PCR-Select®).
15
Fluxograma da biblioteca subtrativa:
Síntese do cDNA fita sim
p
les
Síntese do cDNA fita du
p
la
Cliva
g
em com Rsal
Ligação dos adaptadores
Primeira Hibridiza
ç
ão
Se
g
unda Hibridiza
ç
ão
Amplificação por PCR
RESULTADOS E DISCUSSÃO:
Com o intuito de se investigar o efeito do chorume sobre a espécie juvenil
do Colossoma macropomum (Tambaqui), utilizamos neste trabalho a técnica de
Biologia molecular denominada de Biblioteca Subtrativa com PCR supressivo.
16
Esta técnica permite avaliar qual o conjunto de genes foi diferencialmente
expresso em função da exposição da espécie ao chorume, ou seja, permite
avaliar a expressão gênica envolvida no processo de desencadeamento da
resposta metabólica frente ao contaminante ambiental.
O chorume é o líquido produzido pela massa orgânica do lixo durante o
processo de degradação biológica. Este liquido em contato com a água da
chuva percola a massa do aterro, gera o lixiviado, tóxico (Cabrera & Rodriguez,
1999), com valores elevados de DBO (Demanda Bioquímica de Oxigênio) e
DQO (Demanda Química de Oxigênio), traços de metais dissolvidos (Isidori et
al., 2003; Vilomet et al., 2003), além de ter suas características variando com as
características dos resíduos aterrados e com a idade do aterro, o que o torna
uma água residuaria de difícil tratamento.
Na Amazônia a precipitação varia entre 1500 mm a pouco mais de 3000
mm anuais, o que contribui fortemente para o processo de percolação do
chorume do aterro sanitário da capital Manaus-AM. Outro problema que merece
ser abordado é o tipo de solo da região que favorece o escoamento, de forma
que a água que escorre sobre o aterro e aquela que lixívia é o mesmo que flui
para o lençol freático (Freeman, 1995).
Recentemente, as análises físico-químicas de águas provenientes de
poços particulares em outras regiões da cidade revelaram altas concentrações
de compostos nitrogenados. Portanto, a necessidade de um projeto voltado a
estudos mais detalhados abrangendo esta área, para verificar até que ponto os
rios e igarapés da região do aterro podem estar poluídos e qual o grau de
17
comprometimento da qualidade das águas subterrâneas, da fauna e flora que
nele habitam.
Nos experimentos sob condições controladas, a contaminação por
chorume foi simulada da seguinte forma: Foram expostos 6 animais a uma
concentração de 2,06% de chorume em tanques contendo 50 litros de água e
aeração constante, e 6 peixes foram mantidos em apenas água como controle.
Após a etapa de exposição os animais foram medidos e pesados e o fígado dos
animais foi removido com o auxilio de bisturi e de pinças cirúrgicas.
As amostras de tecidos obtidas foram imediatamente congeladas em
nitrogênio liquido e mantidas a -80°C até o momento da extração do mRNA
(utilizado na construção da biblioteca subtrativa).
Ao final da etapa de construção da biblioteca de genes diferencialmente
expressos em função do chorume, foram obtidos 48 clones. Estes clones
bacterianos foram submetidos à extração de DNA plasmidial e o DNA obtido foi
seqüenciado.
O resultado do seqüenciamento revelou-se que se tratava de 48 distintos
genes expressos diferencialmente em função da presença de chorume.
A busca de similaridade para estas seqüências foi utilizando-se o Blast
2Go e o banco local do laboratório de Bioinformática coordenado pelo Dr. Sergio
Nozawa.
A tabela 1 apresenta para cada clone seqüenciado a sua similaridade
com as seqüências dos bancos de dados de peixes.
18
Destacamos entre os genes analisados clones de interesse, que podem
ser selecionados como bioindicadores de degradação ambiente por chorume.
Os clones B11 e B12 contem fragmentos de DNA com alta similaridade, a
subunidade 3 do citocromo oxidade C, os genes da cadeia respiratória estão
sempre associados ao estresse oxidativo, o que nos leva a inferir que o
metabolismo celular passou a consumir mais oxigênio na presença deste
poluente. Fato este que pode ser atribuído a composição do chorume, rico em
metais pesados, o que acarretaria a ativação de bombas de efluxo reduzindo a
concentração interna de íons, como reportado por Hu et al; (2005), para
Caulobacter crescentus quando exposto a vários metais pesados.
O fenômeno de estresse oxidativo por sua vez pode gerar danos na
estrutura do DNA, fato esse que explicaria a presença dentre os genes
solucionados na biblioteca de genes envolvidos no reparo do DNA (clones: D1;
D2; B6 e C8).
Podemos, portanto propor que estes genes de reparo e de estresse
oxidativo podem ser utilizados como indicadores de degradação ambiental por
chorume.
19
TABELA 1: Resultado da busca por similaridade para os clones da Biblioteca
subtrativa de exposição ao chorume.
Identificação do
clone na Biblioteca
Descrição funcional
D6, B2 CD45
B3 DEADH Box 56 RNA helicase
B4 A disintegrin and metalloproteinase domain 8
B6, C8 E2A-1 transcription factor
B7 Novel immune-type receptor 10
B9 Heterogeneous nuclear ribonucleoprotein-like
B11, B12 Cytochromo C oxidade subunit 3
C2 Putative Chymotrypsin-like protein
C3 Ribosomal protein L27a
C4 CBF1 interacting corepressor
C5 Acyl-coenzyme A dehydrogenase C-2 to C-3 short chain
C6 60S ribosomal protein L11
C7 Small nuclear ribonucleoprotein polypeptide A
C10 CD4-like protein 2
C11 Sterol-C4-methyl oxidase-like
C12 Leukocyte immune-type receptor TS32. 17L2. 1ª
D1, D2 Chromodomain-helicase-DNA-binding protein 6
D3 Peroxiredoxin 6
D4 40S ribosomal protein S10
D5 CBF1 interacting corepressor
20
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